Nowoczesne metody badawcze

Czym jest chromatografia

W wielu dziedzinach nauki i techniki spotykamy się z problemem rozdziału, wykrycia i wyodrębnienia poszczególnych składników wchodzących w skład złożonych mieszanin. Jak rozwiązać te trudne zadania? Jednym że sposobów jest zastosowanie chromatografii.

Początki - chromatografia cieczowa

Pierwszego chromatograficznego rozdziału mieszaniny barwników organicznych dokonał w Warszawie profesor Michaił Cwiet. W oryginalnym opisie doświadczenia datowanym na 23 kwietnia 1905 r. znajdujemy informację, że użyto kolumny szklanej wypełnionej sproszkowanym węglanem wapnia (kredy). Chloroformowy roztwór barwników organicznych, nanoszony na wierzchołek kolumny, w miarę przechodzenia przez warstwę kredy ulegał rozdziałowi i poszczególne składniki były widoczne w postaci barwnych stref. Po wyjęciu słupka kredy z kolumny można było go podzielić i wyodrębnić poszczególne składniki. Następnie zamiast kredy zaczęto stosować inne, bardziej efektywne wypełnienia kolumn (adsorbenty), dające lepsze rozdziały. A co zrobić wówczas, gdy związek organiczny nie daje barwnych stref na wypełnieniu kolumny i nie można zidentyfikować go wzrokiem? No cóż, wtedy trzeba stosować specjalne metody, opisane w dalszej części.

Mimo niewątpliwych zalet, chromatografia kolumnowa była kłopotliwa w praktyce (nie znano wówczas wydajnych adsorbentów) i dlatego początkowo stosowano ją w laboratoriach chemicznych.

Wrócono do niej po latach. Wyciek z kolumny (tzw. eluat) zbierano w małych porcjach, początkowo ręcznie zmieniając odbieralniki, a później automatycznie w określonych odstępach czasu. W zebranych porcjach eluatu rożnymi metodami analitycznymi oznaczano zawartość poszczególnych składników mieszaniny. Na tej podstawie można było wykonać wykres zmian stężenia interesującego nas w eluacie składnika w funkcji czasu. Im większa była ilość porcji eluatu, tym wykres był dokładniejszy, ale tym bardziej wydłużał się całkowity czas oznaczenia, składający się z czasu chomatografowania i czasu analizy składnika. Oczywiście na czas chomatografowania wpływał także dobór kolumny: jej długość, średnica, rodzaj wypełnienia i skład cieczy - fazy ruchomej użytej do rozwinięcia chromatogramu. Jako fazy ruchome stosowano pojedyncze rozpuszczalniki albo ich mieszaniny w rożnych stosunkach objętościowych. Fazy ruchome ułożono w tak zwany szereg eulotropowy, w zależności od zdolności wymywania substancji z kolumny. Jako wypełnienia kolumn stosowano najczęściej żele krzemionkowe lub tlenek glinu w postaci granulek o wymiarach ułamka milimetra - np. 0,1 mm. W preparatyce organicznej opisywaną powyżej technikę chromatografii stosuje się do dzisiaj. Powodem renesansu chromatografii kolumnowej jest fakt, że pozwala ona na efektywny rozdział mieszanin reakcyjnych i uzyskanie czystych składników w ilościach gramowych.

Zamiast kolumny - bibuła

Szukając sposobów upraszczania i przyspieszania rozdziałów chromatograficznych, kolumnę zastąpiono bibułą. Na pasek bibuły nanosi się mikrostrzykawką plamkę (o średnicy do 2mm) roztworu rozdzielanej mieszaniny. Koniec paska z naniesioną plamką zanurza się w zamkniętym naczyniu w takiej ilości fazy ruchomej, aby plamka była nad jej powierzchnia. Faza ruchoma, podobnie jak w chromatografii kolumnowej, może składać się z jednego rozpuszczalnika lub być ich mieszaniną. Fazę ruchomą często określa się mianem układu rozwijającego. Ciecz wznosząc się w bibule do góry (jest to przykład występowania efektu kapilarnego - bibułę można rozpatrywać jako zbiór kapilar), zabiera że sobą składniki mieszaniny, z których jedne wędrują szybciej, inne wolniej. Różnice w szybkości migracji poszczególnych składników mieszaniny wynikają z ich odmiennego oddziaływania z fazą stacjonarną (bibuła). W wyniku występowania efektu kapilarnego i różnic w oddziaływaniu z fazą stacjonarną, następuje rozdział mieszaniny i otrzymuje się chromatogram w postaci plamek. Jest to chromatografia bibułowa wstępująca. Niekiedy stosuje się chromatografię zstępującą, w której faza ruchoma migruje w bibule do dołu.

Dla danego składnika mieszaniny na tej samej fazie stacjonarnej i w tym samym układzie rozwijającym, stosunek odległości plamki od punktu startu (a) do odległości czoła układu rozwijającego (b) określony jest jako:

R_f=a/b

Współczynnik R_f jest wielkością stałą, charakterystyczną dla danej substancji organicznej i może posłużyć do jej identyfikacji. Przy analizie mieszanin zawierających składniki barwne, plamki odpowiadające poszczególnym związkom chemicznym wchodzącym w skład mieszaniny można zlokalizować wzrokiem. Gdy plamki nie są barwne (w skład mieszaniny wchodziły związki bezbarwne), dąży się do ich wizualizacji. Do "wywoływania" chromatogramów stosuje się pary jodu, pary bromu, roztwór waniliny w kwasie solnym i wiele innych odczynników w zależności od rodzaju rozdzielanych substancji. Istotą procesu "wywoływania" chromatogramu są reakcje barwne zachodzące pomiędzy wyodrębnionymi składnikami (lub tylko jednym z wyodrębnionych składników) i odczynnikiem użytym do wizualizacji plamek. W przypadku rozdziału mieszanin substancji "znakowanych" izotopami radioaktywnymi, do bibuły przykłada się kliszę fotograficzną, na której po wywołaniu otrzymuje się obraz rozdzielonych składników mieszaniny. Wielkość i zaczernienie plamki, pozwala również na ilościową ocenę zawartości składnika w mieszaninie.

Jakość rozdziału bardzo zależy od rodzaju użytej bibuły. "Zwykła" bibuła nie jest najlepszym podłożem do chromatografii, w tym celu produkowane są specjalne rodzaje bibuły.

Cienka warstwa - lepsza od bibuły

Udoskonaleniem chromatografii bibułowej jest chromatografia cienkowarstwowa. Zamiast bibuły stosuje się płytkę szklaną lub folię aluminiową pokrytą warstwą żelu krzemionkowego, tlenku glinu lub celulozy. Do celów analitycznych stosuje się grubości warstw rzędu 0,15 mm. Chromatografia cienkowarstwowa ma pewne zalety w stosunku do bibułowej. Rozwijanie chromatogramu jest zwykle szybsze, plamki są mniej rozmyte niż na bibule i można wykrywać mniejsze ilości substancji. Nanoszenie plamek, rozwijanie chromatogramu, wywoływanie i ilościowe oznaczanie zawartości poszczególnych składników wykonuje się podobnie jak w przypadku chromatografii bibułowej. Chromatografia cienkowarstwowa znalazła również zastosowanie w preparatyce. W tym celu rozdział mieszaniny prowadzi się na płytkach o grubszej warstwie adsorbenta - na przykład 3mm. Rozdzielaną mieszaninę nanosi się nie punktowo, ale w linii na długości kilkunastu centymetrów. Po rozdziale warstwę adsorbenta zawierającą wyodrębniony składnik mieszaniny się zeskrobuje, a sam składnik ekstrahuje się (wypłukuje) rozpuszczalnikiem i po zatężeniu oraz odsączeniu adsorbenta otrzymuje w stanie czystym.

W ostatnich latach opracowano nowy sposób rozwijania chromatogramów na cienkich warstwach w pozycji poziomej. Sposób ten wymaga mniejszej ilości układu rozwijającego i umożliwia wielokrotne użycie płytek.

Jest wiele innych rodzajów chromatografii, np. gazowa czy wysokosprawna chromatografia cieczowa; wymagają one jednak osobnego omówienia.

Piotr Leszczyński, UW (KCh 3/93)

Najprostsza chromatografia

W każdej klasie szkolnej są gotowe kolumny chromatograficzne. Bierzemy możliwie długi kawałek kredy do pisania po tablicy i przycinamy go tak, by był prostopadłościanem i mógł stać pionowo. W odległości ok. 1,5 cm od podstawy zaznaczamy czarnym lub brązowym flamastrem linię równoległą do podstawy. Ponieważ nasz kawałek kredy ma 4 boczne ściany, możemy równocześnie wypróbować 4 flamastry.

Na spodeczek lub talerzyk nalewamy kilkumilimetrową warstwę wody i stawiamy na to naszą "kolumnę chromatograficzną". Kreda szybko nasiąka wodą, woda rozwija ku górze chromatogram, na którym pojawiają się barwne pasma utworzone przez barwniki, wchodzące w skład pozornie jednobarwnego flamastra.

Michaił Cwiet

Urodził się w 1872 r. we Włoszech jako syn Rosjanina i Włoszki. Studiował w Genewie nauki przyrodnicze i obronił tam doktorat, po czym przyjechał do Rosji. Przez kilka lat wykładał w Petersburgu, ale w roku 1901 przeniósł się do Warszawy i został tzw. privat-docentem na Uniwersytecie Warszawskim, który wówczas był uczelnią praktycznie czysto rosyjską. W 1907 r. Cwiet został profesorem botaniki i agronomii, a w 1908 r. przeniósł się na Politechnikę Warszawską. W Warszawie wykonał swoje najważniejsze prace. Ogółem opublikował ich ok. 40, ale tylko kilka z nich było ściśle botanicznych - reszta miała więcej wspólnego z chemią.

Najważniejsze prace rozpoczęły się od spostrzeżenia, że węglan wapnia, z którym rozcierano liście roślin, zatrzymuje większość barwników roślinnych, ale nie zatrzymuje karotenu. Kilka lat doświadczeń umożliwiło rozwinięcie tego spostrzeżenia w nową metodę rozdzielania substancji, którą Cwiet nazwał w 1906r. chromatografią. Jednym z pierwszych doniosłych odkryć, dokonanych za pomocą chromatografii było udowodnienie, że chlorofil występuje w roślinach w dwóch odmianach, zwanych obecnie chlorofilem a i b. Wielu wybitnych chemików ówczesnej doby nie chciało zaakceptować metod i wyników Cwieta, ale z biegiem czasu w większości przypadków okazało się, że to on miął rację.