ChemFan - Nowoczesne metody badawcze - Elektroforeza kapilarna

Elektroforeza kapilarna (CE) jest stosunkowo nową, dynamicznie rozwijającą się techniką rozdziału mieszanin chemicznych
Historycznie pierwszy raz elektroforeza została zastosowana do rozdziału mieszaniny białek przez szwedzkiego uczonego Tisseliusa, w 1930 roku. Po wypełnieniu rurki (rurka w kształcie litery U) roztworem białek i umieszczeniu w jej obu końcach elektrod, połączonych z zewnętrznym źródłem napięcia, stwierdził on iż białka wędrują w kierunku elektrod z różnymi prędkościami.
W wolnym roztworze efekt rozdziału jest jednak organiczny przez dyfuzję termiczną oraz konwekcję rozdzielanych cząsteczek. Z tego powodu w dalszym rozwoju elektroforezy wprowadzono środowisko antykonwekcyjne. Roztwór elektrolitu umieszczano w żelach, takich jak agaroza, poliakrylamid czy bibule chromatograficznej.
Kolejnym etapem w rozwoju elektroforezy jest zastosowanie w późnych latach 70 kapilar o małej średnicy (rzędu mikrometrów), a technika ta nosi nazwę elektrofroforezy kapilarnej, łączy ona w sobie szybkość, odtwarzalność oraz łatwość automatyzacji całego procesu.

Aparatura

Aparatura do elektroforezy kapilarnej jest stosunkowo prosta, schemat podstawowego zestawu przedstawiono na rysunku 1.

Rozdział przeprowadza się w kapilarach ze stopionej krzemionki (kwarcu) SiO₂ wypełnionych roztworem elektrolitu nośnego. Najczęściej stosowane są kapilary o średnicy wewnętrznej 25–75 µm i długości około 50 cm. Z zewnątrz, stopiona krzemionka pokryta jest warstwą poliamidową, celem zwiększenia jej wytrzymałości (Rys.2.).

Końce kapilary umieszczone są w dwóch naczyniach, również wypełnionych elektrolitem podstawowym. W jednym z naczyń znajduje się katoda (-), a w drugim anoda (+). Elektrody (Pt) połączone są ze źródłem wysokiego napięcia, w granicach od 10 do 30 kV, pracującym w zakresie prądowym od 0 do 200 mA.
Próbkę badaną wprowadza się do anodowego końca kapilary, natomiast przy katodowym końcu najczęściej znajduje się detektor.
Cześć wysokonapięciowa układu, ze względów bezpieczeństwa, umieszczana jest w obudowie z plexi (polimetakrylanu metylu), często kapilara jest dodatkowo termostatowana.
Cały układ (detektor, zasilacz wysokiego napięcia, system wstrzykiwania próbki oraz napełniania kapilary elektrolitem) kontrolowany jest za pomocą komputera. W chwili obecnej na rynku dostępny jest szeroki wybór komercyjnych, w pełni zautomatyzowanych, aparatów do elektroforezy kapilarnej. Na rysunku 3 przedstawiono zdjęcie aparatu do elektroforezy kapilarnej firmy Waters - Capillary Ion Analyzer.

Zasady rozdziału

Podstawą rozdziałów elektroforetycznych jest różnica w prędkościach migracji cząstek obdarzonych ładunkiem w stałym polu elektrycznym. Posiadające ładunek dodatni kationy przyciągane są przez katodę (-), a aniony przez anodę (+). Prędkość migracji v[cm·s^-1] w kierunku elektrod jest różna dla różnych cząsteczek i zależy od natężenia pola elektrycznego E [V/cm] oraz ruchliwości elektroforetycznej:

Ruchliwość elektroforetyczna µ_ef [m²·V^-1·s^-1] jest wielkością charakterystyczną dla danej cząsteczki i opisana jest następującym równaniem:

z którego wynika, iż jest ona proporcjonalna do wartości ładunku cząsteczki q [C], a odwrotnie proporcjonalna do lepkości środowiska η [kg·m^-1·s^-1] i promienia cząsteczki r[cm] (czym mniejsza cząsteczka i większy ładunek tym większa szybkość migracji).
W elektroforezie kapilarnej decydujące znaczenie ma jeszcze jedno zjawisko, a mianowicie elektroosmoza. Gdy do końców kapilary wypełnionej roztworem elektrolitu przyłożymy wysokie napięcie, obserwujemy przepływ elektroosmotyczny, który polega na przemieszczaniu się całej masy elektrolitu w kierunku jednej z elektrod.
Przyczyną przepływu elektroosmotycznego jest obecność podwójnej warstwy elektrycznej, która powstaje na granicy faz roztwór/ścianka kapilary. Przy wartości pH większej od 3, wewnętrzna ścianka kapilary ze stopionej krzemionki posiada ładunek ujemny, który związany jest z dysocjacją grup silanolowych (SiOH), przy niższym pH jonizacja nie jest całkowita.
Kationy elektrolitu podstawowego przyciągane są przez ładunki ujemne na ściankach kapilary (SiO^-), co powoduje powstanie wewnętrznej (związanej) oraz zewnętrznej (dyfuzyjnej) warstwy kationów, powstaje podwójna warstwa elektryczna (Rys.4.).

Rys.4. Schemat podwójnej warstwy elektrycznej powstającej przy ściance kapilary.

Kationy warstwy zewnętrznej przyciągane są przez ujemną katodę, a ponieważ kationy te są solwatowane przez cząsteczki rozpuszczalnika, „porywają” one razem ze sobą cała masę roztworu znajdującego się w kapilarze.
Szybkość przepływu elektroosmotycznego jest zazwyczaj większa od szybkości elektroforetycznych poszczególnych jonów, co powoduje, że zarówno kationy, cząstki obojętne jak i aniony poruszają się w kierunku katody (-).
W obecności przepływu elektroosmotycznego, szybkość z jaką dany jon porusza się w kierunku katody v_obs (szybkość obserwowana) opisana jest następującą zależnością:

gdzie: µ_eo – ruchliwość elektroosmotyczna. W przypadku anionów µ_efjest wartością ujemna.

W rezultacie kolejność, w jakiej rozdzielane cząstki docierają do katodowego końca kapilary jest następująca: najpierw małe obdarzone dużym ładunkiem kationy, następnie większe kationy o mniejszym ładunku, nierozdzielone cząsteczki obojętne, duże aniony o małym ładunku, a na koniec małe aniony posiadające duży ładunek elektryczny (Rys.5.).

Rys.5. Kolejność w jakiej rozdzielane cząsteczki poruszają się w kierunku katody.

Dzięki temu, że przepływ elektroosmotyczny jest generowany przy ściankach kapilary na całej jej długości, charakteryzuje się on stała szybkością przepływu w całym jego przekroju (Rys.6).

Rys.6. Przekrój podłużny przepływu elektroosmotycznego oraz laminarnego.

Płaski profil przepływu elektroosmotycznego jest bardziej korzystny od przepływu laminarnego, spotykanego np. w technikach chromatograficznych. W przypadku przepływu laminarnego, który jest wymuszony przez zastosowanie ciśnienia na jednym z końców kapilary, roztwór znajdujący się w jej środku porusza się szybciej niż roztwór będący bliżej ścianek. Obecność przepływu laminarnego powoduje poszerzenie długości zajmowanej przez próbkę w kapilarze i co za tym idzie również poszerzenie sygnałów z detektora.
Możliwe jest również odwrócenie kierunku przepływu elektroosmotycznego przez odpowiednią modyfikację ładunku na ściankach kapilary, np. przez dodanie do roztworu elektrolitu surfaktanata kationowego (związek powierzchniowo czynny). Surfaktant ulega adsorpcji na ściankach kapilary, przez co ścianki zyskują ładunek dodatni. Przepływ elektroosmotyczny może być także wyeliminowany przez odpowiednią modyfikacje ścianek kapilary.
Głównym ograniczeniem w szybkości, rozdzielczości oraz skali rozdziałów elektroforetycznych jest ciepło Joule’a generowane, gdy przez roztwór elektrolitu przepływa prąd elektryczny. W przypadku stosowanych w CE kapilar, wytwarzane w roztworze ciepło z łatwością rozpraszane jest do otoczenia. Możliwe jest to dzięki korzystnemu stosunkowi powierzchni kapilary do jej objętości przy tak małych średnicach wewnętrznych.
Dodatkowym czynnikiem wpływającym korzystnie na rozdzielczość oraz zmniejszenie wysokości półki teoretycznej jest brak fazy stacjonarnej. Elektroforeza kapilarna w rutynowych zastosowaniach pozwala osiągnąć liczbę półek teoretycznych w granicach od 50000 do 500000.

Metody wprowadzania próbki

Roztwór próbki badanej w większości przypadków wprowadzany jest do anodowego końca kapilary. Typowe objętości wstrzykiwanej próbki wahają się od 10 do 100 nl. Najczęściej stosowaną metodą jest umieszczenie anodowego końca kapilary w naczyniu z roztworem próbki, znajdującym się wyżej względem katodowego końca kapilary, metoda hydrodynamiczna – grawitacyjna (trzy podstawowe metody wprowadzania próbki przedstawiono schematycznie na rysunku 7).
Inna hydrodynamiczna metoda wstrzykiwania polega na umieszczeniu końca kapilary w szczelnym zbiorniku z próbką i zastosowaniu wysokiego ciśnienia.
Popularna jest także metoda elektrokinetyczna, w przypadku której, w naczyniu z próbka umieszczana jest anoda, a następnie do końców kapilary przykładane napięcie rzędu 5 kV, mieszanina rozdzielana wprowadzana jest do kapilary dzięki przepływowi elektroosmotycznemu.

Rys.7. Metody wprowadzania próbki: a) hydrodynamiczna – grawitacyjna, b) hydrodynamiczna – ciśnieniowa, c) elektrokinetyczna.

Metody detekcji

Dzięki temu, ze w CE wszystkie składniki rozdzielanej mieszaniny przechodzą przez jeden wspólny punkt (katodowy koniec kapilary), większość stosowanych detektorów jest zbliżona do tych używanych w HPLC.
W tabeli 1 zestawione są najczęściej spotykane w elektroforezie kapilarnej techniki detekcji oraz odpowiadające im limity detekcji.

Metoda detekcji	Limit detekcji (mol/dm³)
Spektrofotometria
Absorbcyjna	10^-5 – 10^-6
Fluorescencyjna	10^-10 – 10^-16
NMR	10^-3
Elektrochemia
Konduktometria	10^-7 – 10^-8
Potencjometria	10^-7 – 10^-8
Amperometria	10^-7 – 10^-8
Radiometria	10^-10

Podstawowe odmiany elektroforezy kapilarnej

Elektroforeza kapilarna w wolnym roztworze. Jest to podstawowa odmiana, w której rozdział polega na różnicy w szybkościach migracji poszczególnych jonów, a zasady jej działania zostały omówione powyżej. Głównym ograniczeniem jest możliwość rozdziału jedynie cząstek posiadających ładunek elektryczny. Elektroforogram otrzymany przez elektroforetyczny rozdział 27 kationów zamieszczono na rysunku 8.

Rys.8. Elektroforogram otrzymany dla mieszaniny 27 kationów (detekcja spektrofotometryczna, długość fali 214 nm). Kolejne sygnały odpowiadają następującym kationom: (1) K⁺, (2) Ba²⁺, (3) Sr²⁺, (4) Na⁺, (5) Ca²⁺, (6) Mg²⁺, (7) Mn²⁺, (8) Cd²⁺, (9) Li⁺, (10) Co²⁺, (11) Pb²⁺, (12) Ni²⁺, (13) Zn²⁺, (14) La³⁺, (15) Ce³⁺, (16) Pr³⁺, (17) Nd³⁺, (18) Sm³⁺, (19) Gd³⁺, (20) Cu²⁺, (21) Tb³⁺, (22) Dy³⁺, Ho³⁺, (24) Er³⁺, (25) Tm³⁺, (26) Yb³⁺, (27) Lu³⁺.[7]

Micelarna elektrokinetyczna chromatografia kapilarna jest odmianą CE pozwalająca na rozdział cząstek obojętnych. Stosowane są jonowe związki powierzchniowo czynne w stężeniu przekraczającym krytyczne stężenie micelarne (CMC).
Do najczęściej stosowanych surfaktantów anionowych należy SDS (C₁₂H₂₅OSO₃^-Na⁺).
Budowę pojedynczej cząsteczki surfaktanta oraz micele tworzące się powyżej CMC przedstawiono schematycznie na rysunku 9.

Rys.9. Monomer surfaktanta anionowego, micele tworzące się powyżej CMC oraz równowaga jaka ustala się gdy w roztworze znajduje się substancja elektrycznie obojętna. W przypadku surfaktanta anionowego takiego jak SDS micele posiadają sumaryczny ładunek ujemny.

Gdy w roztworze brak jest surfaktanta, lub jego stężenie nie jest wystarczające aby powstały micele, cząstki obojętne poruszają się z szybkością równą szybkości przepływu elektroosmotycznego.
Natomiast w przypadku obecności miceli, rozdzielana substancja elektrycznie obojętna ulega podziałowi między roztwór elektrolitu, a niepolarne wnętrze miceli (Rys.9.).
Cząsteczka obojętna znajdując się we wnętrzu miceli przemieszcza się razem z nią, a rozdział dokonuje się na podstawie różnic współczynników podziału dla różnych substancji.
Przy najczęściej stosowanym surfaktancie anionowym (SDS) micele posiadają ładunek ujemny. Cząsteczka niepolarna, znajdująca się we wnętrzu takiej miceli porusza się wolniej od przepływu elektroosmotycznego (przepływ elektroosmotyczny w kierunku katody).

Kapilarna elektroforeza żelowa. Jest to odmiana elektroforezy żelowej, przez ostatnie trzy dekady stosowanej szeroko w biochemii. W technice tej wypełnienie kapilary stanowi żel (najczęściej liniowy polimer), a o rozdziale substancji decydują rozmiary cząsteczek – sączenie molekularne.
Metoda ta znalazła zastosowanie w rozdziale makromolekuł takich jak peptydy, białka oraz DNA.

Izoelektryczne ogniskowanie. Wariant ten stosowany jest do rozdziału cząsteczek amfiprotycznych, zdolnych posiadać zarówno ładunki dodatnie, jak i ujemne (np.: aminokwasy, peptydy, białka). Przy pewnej charakterystycznej wartości pH, ładunek dodatni takich cząsteczek jest dokładnie równy ładunkowi ujemnemu, cząsteczka jest elektrycznie obojętna i nie porusza się w polu elektrycznym.
W przypadku ogniskowania izoelektrycznego kapilara wypełniona jest roztworem buforowym o różnej wartości pH, której gradient we wnętrzu kapilary pozostaje stały w czasie, gdy przykładane jest napięcie. Próbka wprowadzana jest do końca kapilary o niższej wartości pH, a składniki rozdzielanej mieszaniny posiadające ładunek dodatni wędrują w kierunku detektora.
W momencie, gdy składniki mieszaniny rozdzielanej znajdą się w części kapilary gdzie wartość pH odpowiada punktowi izoelektrycznemu (ilość ładunków dodatnich jest dokładnie równa ilości ładunków ujemnych) danej cząstki, wędrówka ustaje. Następnie odłączone zostaje wysokie napięcie, a roztwór wypchnięty z kapilary przez zastosowanie wysokiego ciśnienie na jednym z jej końców.

Pojęcia i skróty używane w tekście:

elektrolit – Terminu elektrolit używa się w dwóch nieco innych znaczeniach. W pierwszym, oznacza on substancję, która rozpuszczona dysocjuje, dając roztwór przewodzący jonowo. Rozróżnia się elektrolity słabe i mocne.
W drugim znaczeniu elektrolitem nazywa się każdy ośrodek przewodzący jonowo (roztwór zawierający jony lub stopiona sól). W tym znaczeniu mówi się o elektrolicie akumulatora lub elektrolicie w przestrzeni elektrodowej elektrolizera.

podwójna warstwa elektryczna – Składa się ona z dwóch warstw ładunków o znakach przeciwnych. Jedna z tych warstw może być rozmyta, jak np. w modelu cząstek koloidalnych, w którym ładunek cząstki przyciąga rozmytą atmosferę jonową w roztworze otaczającym cząstkę. Do opisu podwójnej warstwy elektrycznej zaproponowano kilka modeli (model Helmholtza, model Gouya-Chapmana i model Sterna).

HPLC – (ang. high performance liquid chromatography) wysokosprawna chromatografia cieczowa

krytyczne stężenie micelarne (CMC) – Jest to stężenie roztworu cząsteczek mających na jednym końcu grupę hydrofobową, a na drugim hydrofilową, powyżej którego tworzą się w nim micele. Micele są klasterami cząsteczek o wymiarach typowych dla cząstek koloidalnych.

półka teoretyczna – Liczba półek teoretycznych jest miarą skuteczności technik rozdziału (takich jak destylacja frakcjonowana lub chromatografia). Liczba półek teoretycznych wyraża liczbę kroków podziału między dwie fazy potrzebnych, aby z roztworu o danym składzie wyjściowym otrzymać roztwór o zadanym składzie.

substancje amfiprotyczne – Jest to cząsteczka zdolna zarówno do przyjęcia jak i oddania protonu. Typowy aminokwas jak glicyna jest substancja amfiprotyczną. W wodnym roztworze glicyny ustalają się trzy następujące równowagi:

NH₂CH₂COOH ↔ NH₃⁺CH₂COO^-
NH₃⁺CH₂COO^- + H₂O ↔ NH₂CH₂COO^- + H₃O⁺
NH₃⁺CH₂COO^- + H₂O ↔ NH₃⁺CH₂COOH + OH^-

surfaktant – substancja powierzchniowo czynna (np. mydło, detergenty syntetyczne). Cząsteczka surfaktanta może się składać z fragmentów polarnych i niepolarnych. W niskich stężeniach jest równomiernie rozmieszczona w roztworze. W wysokich tworzy micele.

współczynnik podziału – Jest to fundamentalna wielkość leżąca u podstaw technik chromatograficznych. Współczynnik podziału można wyrazić równaniem Nernsta: K = C_s/C_m, w którym C_s i C_m oznaczają stężenie danej substancji w fazie stacjonarnej (hydrofobowe wnętrze miceli – faza pseudostacjonarna) i ruchomej (elektrolit podstawowy).

Materiały źródłowe:

[1] Peter William Atkins, Przewodnik po chemii fizycznej, PWN 1997
[2] Daniel C. Harris, Quantitative Chemical Analysis, W.H Freeman and Company, NY 1999
[3] Walenty Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN 1996
[4] Paul D. Grossman, Joel C. Colburn, Capillary Electrophoresis – Theory and Practice, Academic Press INC., 1992
[5] F.Foret, L. Krivankova, P. Bocek, Capillary Zone Electrophoresis, VCH Publishers, Inc., NY1993
[6] Kelly Swinney, Darryl J. Bornhop, Detection in capillary electrophoresis (Review), Electrophoresis 2000, 21, 1239-1250
[7] Miroslav Macka, Paul R. Haddad, Determination of metal ions by capillary electrophoresis (Review), Electrophoresis 1997, 18, 2482-2501