B. Typy łańcuchów oligocukrowych

1. N-glikany

• wysokomannozowe zawierające wyłącznie D-mannozę przyłączoną do rdzenia
  

  Man1-2Man1-	6 3	Man1
  Man1-2Man1-				6 3	Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
  Man1-2Man1-2Man1-	2	Man1

• złożone charakteryzujące się wieloma rozgałęzieniami rozpoczynającymi się resztami GlcNAc, przyłączonymi do cząsteczek mannozy rdzenia. Takie "ramiona" (od 1 do 4) mogą być wydłużane poprzez dodawanie D-galaktozy, N-acetylo-D-galaktozoaminy, L-fukozy i kwasów sjalowych.
  

  		GlcNAc1				Fuc1
  Neu-NAc2-6Gal1-4GlcNAc1-6 Neu-NAc2-6Gal1-4GlcNAc1-4 Neu-NAc2-6Gal1-4GlcNAc1-2	Man1		6 3	| 4		| 6
  				Man1	-4GlcNAc1	-4GlcNAc	-Asn
  Neu-NAc2-3Gal1-4GlcNAc1-4 Neu-NAc2-6Gal1-4GlcNAc1-2	Man1

• hybrydowe, gdy w łańcuchu oligocukrowym występują różne typy rozgałęzień. Stanowią one połączenie dwóch wcześniejszych typów: to jest wysokomannozowych i złożonych.
  

  Man1-6 Man1-3	Man1		6 3
  				Man1	-4GlcNAc1	-4GlcNAc	-Asn
  Neu-NAc2-3Gal1-4GlcNAc1-4 GlcNAc1-2	Man1			4 |		6 |
  		GlcNAc1				Fuc1

• łańcuchy poli-N-acetyloglukozozoaminowe charakteryzują się wielokrotnie występującą sekwencją (Gal1-4GlcNAc1-) przyłączoną do rdzenia. Powtarzającą się sekwencja może być rozgałęziana za pomocą GlcNAc-trasferazy Gal1-4GlcNAc1-6(Gal1-4GlcNAc1-3)Gal.

2. O-glikany

• monocukrowe zawierające GalNAc-Ser/Thr (Schacter 1994) lub związaną wiązaniem glikozydowym Fuc (Harris i Spellman 1993)
• dwucukrowe jak sjalo2-6GalNAc-Ser/Thr
• większe O-glikany które można dalej podzielić na sześć podtypów:
  • Gal1-3GalNAc-R - najbardziej popularny (Schacter 1986)
  • GlcNAc1-6(Gal1-3)GalNAc-R
  • GlcNAc1-3GalNAc-R
  • GlcNAc1-6(GlcNAc1-3)GalNAc-R
  • GlcNAc1-3GalNAc-R
  • GlcNAc1-6GalNAc-R / gdzie R to -Ser/Thr.

3. Glikany z nietypowymi wiązaniami

4. Różnice pomiędzy glikoproteinami roślinnymi a zwierzęcymi

5. Glikoproteiny grzybów

II. Analiza struktury komponenty cukrowej

A. Wykrywanie obecności cukrów w białkach

1. Inerakcje z lektynami

2. Metoda fenolowa

	-3H2O
-D-ryboza		Furfural

Istnieją odmiany metody fenolowej jak:

• próba Molischa z -naftolem: dająca reakcję z każdym cukrem
• próba Seliwanowa z rezorcyną na zawartość ketoz
• próba Biala z orcyną pozwalająca wykryć obecność pentoz

3. Barwienie kwasem nadjodowym i fuksyną - reakcja PAS

• glikogen
• skrobia
• celuloza.

• mukopolisacharydy
• glikoproteiny i glikolipidy.

HIO4

F

Schemat reakcji PAS; F- odczynnik Schiffa (fuksyna)

B. Znakowanie i metody detekcji mono- i oligosacharydów

1. Absorpcja promieniowania UV

Tabela 2. (Paulus i Klockow 1996)

Znacznik	Struktura	Długość fali [nm]	Granica wykrywalności [M]
2-aminopirydyna (2-AP)		240	8*10-6
kwas p-aminobenzowy		285	4*10-6
ester etylowy kwasu p-aminobenzowego		305	2*10-6
p-aminobenzonitryl		285	3*10-7
kwas 8-aminonaftalen- 1,3,6-trisulfonowy (ANTS)		223	5*10-7

Oprócz wyżej wymienionych znaczników do znakowania UV używa się takich substancji jak:

• 1-fenylo-3-metylo-5-pirazylon (PMP) " _max = 245 nm
• S-(-)-1-fenetylamina " = 200 nm
• kwas p-aminosulfonowy (SA) " _max = 247 nm
• kwas 2-aminonaftalen-1-sulfonowy (2-ANSA) " = 235 nm
• kwas 3-aminonaftalen-2,7-disulfonowy (3-ANDA) " = 235nm (El Rassi i Mechref 1996)

2. Znakowanie fluorescencyjne

Tabela 3. (Paulus i Klockow 1996)

Znacznik	Struktura
Długość fali wzbudzenia i emisji [nm]	Granica wykrywalności [M]
kwas 8-aminonaftalen-1,3,6-trisulfonowy (ANTS)
(laser He-Cd) 325/520 (laser Ar) 275/520	5*10-81*10-9
3-(4-carboksybenzoilo)-2-chinolino carboksy aldehyd (CBQCA)
(laser Ar) 457/552	3*10-9
ester sukcynimidylowy 5-karboksytetra-metylorodaminy (TRSE)
(laser He-Ne) 543/580	5*10-11

Oprócz wymienionych w tabeli markerów do znakowania fluorescencyjnego używa się innych związków:

• 2-aminoakridon (2-AA) " _wzb = 425 nm; _em = 520 nm
• 2-aminopirydyna (2-AP) " _wzb = 325 nm; _em = 375 nm
• 6-aminochinolina (6-AQ) " _wzb = 325 nm; _em > 495 nm
• kwas 5-aminonaftalen-2-sulfonowy (5-ANSA) " _wzb = 325 nm; _em = 475 nm
• kwas 7-aminonaftalen-1,3-disulfonowy (ANDSA) " _wzb = 315 nm; _em = 420 nm
• kwas 4-amino-5-hydroksynaftalen-2,7-disulfonowy (AHNS) " _wzb = 325 nm; _em = 475 nm
• kwas 9-aminopiren-1,4,6-trisulfonowy (APTS) " _wzb = 455 nm; _em = 512 nm (El Rassi i Mechref 1996)

3. Znakowanie radioaktywne

4. Wykrywanie cukrów metodą amperometryczną

5. Detekcja cukrów za pomocą refraktometrii

C. Metody otrzymywania wolnych łańcuchów cukrowych

1. Otrzymywanie i oczyszczanie glikopeptydów

a) enzymatyczna i chemiczna fragmentacja białek

• enzymatycznie
• chemicznie (bromocyjanem).

b) rozdział peptydów za pomocą HPLC i identyfikacja glikopeptydów

2. Enzymatyczne metody odcinania oligomerów cukrowych

X1						PN Gaza
X2		Man1				Z |
Y				Man1-4GlcNAc1	-	4GlcNAc	-	Asn
X3		Man1
X4					endoglikozydaza

a) Enzymy uwalniające N-związane reszty sacharydowe:

1. Pierwszym enzymem stosowanym w analizie glikoprotein była endoglikozydaza z Diplococus (Straptococcus) pneumoniae nazywana endo D (Maramatsu 1971). Specyficzność tego enzymu jest ograniczona i nie wszedł on do powszechnego użycia w analizie glikoprotein. Endo D jest w stanie uwalniać od szkieletu peptydowego wysokomannozowe N-glikany, tylko z tych oligosacharydów, w których reszta mannozy związana wiązaniem 1-3 posiada wolną grupę hydroksylową przy węglu C-2 (Maramatsu 1988). Miejsce cięcia tego enzymu, jak i innych omawianych tutaj endoglikozydaz, znajduje się za pierwszą GlcNAc rdzenia.
2. Endoglikozydaza ze Streptomyces plicatus (endo H) została opisana zaraz po endo D, a obecnie rekombinowana jest w E. coli. Odcina reszty wysokomannozowe i hybrydowe N-glikany. Jest nieaktywna wobec złożonych wielocukrów (Trimble i Tarentino 1991).
3. Endoglikozydazy z Clostridium peringens: endo C_I i endo C_II zostały opisane w 1975 roku. W swej specyficzności substratowej są bardzo podobne do endo D i endo H, jednak posiadają większe ograniczenia substratowe, praktycznie nie są używane w analizie glikoprotein (O"Neill. 1996).
4. Endoglikozydazy: endo F₁, F₂, F₃ otrzymano z Flavobacterium meningosepticum obecnie rekombinuje się je w E. coli. Są to bardzo popularne i szeroko stosowane enzymy. Specyficzność endo F₁ jest podobna do specyficzności endo H mając zdolność do odcinania zarówno wysokomannozowych jak i hybrydowych łańcuchów. Endo F₂ jest aktywna wobec wysokomannozowych N-glikanów, wykazując również duże powinowactwo wobec dwuantenowych. Nie posiada za to zdolności do odcinania łańcuchów: hybrydowych, trzyantenowych i czteroantenowych (O"Neill. 1996). Endo F₃, w przeciwieństwie do dwóch wcześniejszych, nie wykazuje powinowactwa do N-glikanów wysokomannozowych (O"Neill. 1996), jest w stanie odcinać oligosacharydy trzyantenowe. Wszystkie trzy endoglikozydazy są przeważnie sprzedawane łącznie jako endoglikozydaza F; preparat ten składa się głównie z endo F₁ oraz małych ilości endo F₂ i F₃. W przypadku prowadzenia reakcji w środowisku glicerolu zaobserwowano przyłączanie glicerolu do redukującego węgla GlcNAc (Trimble i wsp. 1986). Z czasem glicerol zostawał zastąpiony przez wodę (Maley i wsp. 1989). To samo zjawisko odkryto w stosunku do endo H z tym, że proces ten był wolniejszy (Maley i wsp. 1989).
5. Do innych mało popularnych, niebakteryjnych endoglikozydaz można zaliczyć: endo S ze ślimaka Distyostellium discoideum (podobną do endo C_II), grzybowe endo M z Mucor hiemalis oraz endo B ze Sporotrichum dimorphosporum (podobne w działaniu do endo F₂, a różniące się od niej zdolnością cięcia łańcuchów hybrydowych). Istnieją doniesienia o endoglikozydazach z roślin wyższych podobnych do endo C_II oraz ssaków (np. endoglikozydaza z wątroby szczura podobna do endo F₂ (Tachibana, Yamashita i Kobata 1982, Lisman i wsp. 1985)).
   Drugą rodziną enzymów uwalniających grupy oligosacharydowe są
   N-glikozydazy (nazywane inaczej jako: PNGazy, N-glikohydrolazy lub N-glikanazy) odcinające łańcuch cukrowy przy samej asparaginie. W trakcie tego procesu amid kwasu asparaginowego przekształca się w kwas asparaginowy, a oligosacharyd jest uwalniany jako glikozoamina. W stosunku do opisanych wcześniej endoglikozydaz, pozostawiających przy asparaginie cząsteczkę GlcNAc, posiadają wady i zalety. Do wad można zaliczyć fakt utraty przez GlcNAc grupy aminowej na C-1 (Takhaschi 1992) oraz częstą konieczność denaturacji hydrolizowanych glikoprotein, do zalet bardzo szerokie spektrum działania umożliwiające uwolnienie reszty glikozowej bez wcześniejszej znajomości jej struktury.
   
   N-glikozydazy pochodzące z różnych źródeł wydają się być bardzo podobnymi w swej charakterystyce substratowej i umożliwiają trawienie wszystkich typów N-glikanów jak: wysokomannozowe, złożone i hybrydowe. Istnieją pomiędzy nimi jednak subtelne różnice ważne w praktycznym zastosowaniu do analizy N-glikanów.

   1. N-glikozydaza A z migdałów została po raz pierwszy oczyszczona do homogenności przez Taga (Taga 1984) i jest ona w stanie hydrolizować każde wiązanie N-glikozydowe (ciekawostką jest możliwość hydrolizy nawet pojedynczej reszty GlcNAc, która pozostała po działaniu endoglikozydazą, od asparaginy (Plumer i wsp. 1981). Wykazuje ona dużo mniejszą aktywność w stosunku do dużych glikozylowanych białek niż mniejszych glikoprotein, a denaturacja glikoproteiny ułatwia hydrolizę. Przypuszcza się, że większa aktywność w stosunku do mniejszych białek spowodowana jest stosunkowo dużą masą enzymu wynoszącą prawie 80 000 Da (dla porównania masa N-glikozydazy F wynosi tylko 35 000 Da). Ważną cechą tego enzymu jest niezdolność do usuwania N-glikanów z asparaginy położonej blisko C-końca. Jest to cecha charakterystyczna również dla N-glikozydazy F (Plumer i wsp. 1981). Optymalne pH dla działania tego enzymu zawiera się pomiędzy 4 a 6.
   2. N-glikozydaza F otrzymywana z Flavobacterium meningosepticum jest najczęściej używanym enzymem. W przeciwieństwie do PNGazy A, nie jest w stanie odcinać pojedynczej grupy GlcNAc przyłączonej wiązaniem N-glikozydowym do asparaginy. Inną cechą odróżniającą N-glikozydazę F od A jest brak powinowactwa enzymatycznego w stosunku do N-glikanów zawierających fukozę przyłączoną do pierwszej rdzeniowej GlcNAc wiązaniem 1-3. Optymalne pH dla działania tego enzymu wynosi około 8.6.
   3. N-glikozdaza z fasoli wszystkich rodzajów oligosacharydów (O"Neill. 1996). Optymalne pH dla działania tego enzymu wynosi 6.5.

   b) Enzymy uwalniające O-glikany

   Często występująca O-glikozydowa struktura jest Gal1-3GalNAc (Schacter 1986), może być zhydrolizowana przez enzymy prokariotyczne (endo-GalNAc-aza D z Diplococus (Straptococcus) pneumoniae (Endo i Kobata 1976) jak i eukariotyczne (endo-GalNAc-aza A z Alcaligens (Fan, Kadowaki i wsp. 1988). Powyższe enzymy są w stanie hydrolizować tylko dwucukrową strukturę Gal1-3GalNAc bez żadnych podstawień (O"Neill 1996). O-glikany są jednak często bardziej zróżnicowane, a ich fragment Gal1-3GalNAc rozbudowany. Optymalne pH dla tego enzymu wynosi 5.5. Ostatnio pojawiły się doniesienia o nowym, słabo zdefiniowanym enzymie ze Streptomyces opisanym jako endo-GalNAc-aza S (Iwase i wsp. 1988), który jest w stanie hydrolizować większe struktury, niż opisane powyżej, na przykład Gal1-3(Gal-1-4GlcNAc1-6)-GalNAc.

   3. Chemiczne metody odcinania łańcuchów cukrowych

   Metodą stosowaną przez prawie trzy dziesięciolecia jest hydrazynoliza. Zazwyczaj stosowano ją do uzyskiwania puli N- i O-glikanów, chociaż ostatnio donosi się, iż bezwodna hydrazyna jest w pewnych warunkach wysoce specyficzna wyłącznie wobec O-glikanów (O"Neill 1996, Patel i wsp. 1993).
   
   W metodzie hydrazynolizy odwodnione, świeżo przygotowane próby glikoprotein, lub glikopeptydów inkubuje się z minimalną objętością ultraczystej bezwodnej hydrazyny w atmosferze suchego, odwodnionego argonu. W procesie tym ponad 85% N- i O-glikanów zostaje zwolnionych przy inkubacji przez 4 h w 95^oC.
   
   Natomiast O-glikany są uwalniane specyficznie w temperaturze 60^oC i przy inkubacji trwającej 6 h. Modyfikacja metody polega na zauważeniu faktu, iż w niższych temperaturach bezwodna hydrazyna uwalnia powyżej 90% glikanów związanych wiązaniem O-glikozydowym i mniej niż 10% N-glikanów.
   
   Ograniczeniem hydrazynolizy jest utrata grup acetylowych i glikozowych z cukrów podstawionych N-acetylo i N-glikozydowo. W przypadku hydrolizy O-glikanów często otrzymuje się niepożądane pochodne (O"Neill 1996).
   
   Wadą tej metody jest konieczność używania bardzo czystego bezwodnego związku, którego otrzymanie jest niebezpieczne ze względu na toksyczności i wybuchowość.
   
   Inną techniką chemiczną stosowaną do uwalniania reszt cukrowych z glikoprotein i glikopeptydów jest odcinanie łańcucha za pomocą wodorolitku aluminium (Likhosherstow i wsp. 1990).

   D. Sekwencjonowanie enzymatyczne

   Do enzymatycznej analizy struktury łańcuchów oligosacharydowych stosuje się sekwencjonowanie enzymatyczne za pomocą egzo- endoglikozydaz wykazujących bardzo wysoką specyficzność względem:

   • rodzaju mono- i oligosacharydu
   • anomerii (/)
   • rodzaju wiązania
   • stereoizomerii (D/L)
   • rodzaju pierścienia (piranozowy/furanozowy)

   Ilość próby potrzebnej do oznaczania za pomocą egzo- endoglikozydaz waha się (w zależności od czułości i objętości próby wymaganej przez metodę) od 10 do 100 pmoli. Ogólnie wszystkie metody detekcji stosowane w sekwencjonowaniu enzymatycznym dzieli się na dwie grupy: jedna wykorzystuje wielkość cząsteczek np. wszelkiego rodzaju chromatografie, elektroforezy i spektroskopie masowe; druga ich właściwości przestrzenne, rodzaje występujących w nich wiązań np. rozdział z użyciem lektyn i sporadycznie NMR (choć ta ostatnia technika częściej używana jest do analizowania "natywnych" glikanów jeszcze przed trawieniem egzoglikozydazami).
   
   Jako standardu w technikach bazujących na zmianie wielkości cząsteczek używa się zhydrolizowanego standardu dekstranu przygotowanego poprzez ogrzewanie jednego grama dekstranu (200 000 Da) w 10 ml 0.1 M HCl przez 4 h w 100^oC. Przystępując do analizy enzymatycznej należy ustalić z jakim rodzajem glikanu mamy do czynienia. Fakt ten rzutuje potem na rodzaj użytych enzymów. Wybór enzymu jest zwykle uzależniony od składu monosacharydowego próby otrzymanego np. w drodze analizy metylacyjnej połączonej GC-MS lub z użyciem lektyn oraz od drogi glikozylacji (jeśli jest ona znana). Szczególnie ważne przy sekwencjonowaniu enzymatycznym jest ścisłe przestrzeganie warunków inkubacji próby z enzymem. Na przykład w odpowiednich warunkach używając -mannozydazy z Conavalia ensiformis hydrolizie ulegają wiązania Man1<--2,3,6. W innym przypadku niektóre wiązania mogą nie ulegać hydrolizie (Dwek i wsp. 1993). Czynnikami, których należy ściśle przestrzegać są: czystość enzymu, stężenie substratu, pH, siła jonowa, rodzaj użytego buforu, temperatura, czas reakcji. Niezachowanie któregoś z tych warunków może uczynić eksperyment niepowtarzalnym i spowodować błędy w określaniu struktury analizowanej próby.
   
   Przykład najczęściej stosowanych endo- i egzoglikozydaz przy analizie glikanów przedstawia tabela 4. Prócz tych wymienionych w tabeli 4 enzymów stosuje się jeszcze endoglikozydazy wymienione w rozdziale opisującym enzymatyczne uwalnianie reszt cukrowych z glikoprotein i glikopeptydów.
   
   Etap hydrolizy enzymatycznej łączy się z innymi technikami, jak immobilizacja na złożach zawierających lektyny, różne rodzaje chromatografii, elektroforezy, etc.
   
   W ostatnich latach firma Oxford GlycoSystem (katalog Oxford GlycoSystem na rok 1994) prezentuje nowa technikę RAAM będącą pochodną sekwencjonowania enzymatycznego. W technice tej miast używać po kolei szeregu różnych egzoglikozydaz używa się ich mieszaniny. Próbę dzieli się na kilka części i inkubuje każdą w oddzielnych probówkach z odpowiednio dobranymi mieszaninami glikozydaz. Następnie całość zlewa się do jednego naczynia i poddaje analizie. Modyfikacja ta pozwala na określenie struktury glikanów za pomocą "jednego kroku". Wyniki rozdziału chromatograficznego mieszaniny reszt cukrowych otrzymanych w tym procesie poddaje się analizie za pomocą oprogramowania komputerowego.

   Schemat sekwencjonowania metodą RAAM (na podstawie katalogu Oxford GlycoSystems 1994) dla N-glikanu o przykładowej strukturze:
   

   • Oznaczenia cukrów: mannoza; n GlcNAc; u fukoza; s galaktoza.
   • Oznaczenia macierzy RAAM - obecność enzymu o danej specyfice; m - nieobecność danego enzymu

   Używane enzymy:

   1. -Nacetyloheksozoamidaza (S. pneumoniae)
   2. -3/4-fukozydaza (ziarno migdałów)
   3. -fukozydaza (jądra wołu)
   4. -Nacetyloheksozoamidaza (kanawalia mieczokształtna)

   GU - masy produktów reakcji wyrażone są w jednostkach glukozowych. Powstałe produkty zlewa się, powstałą mieszaninę rozdziela się w HPLC.

   Tabela 4. Przykłady glikozydaz używanych w analizie glikanów (Dwek i wsp. 1993).

   Enzym	Oznaczenie EC	Źródło	Specyficzność
   -D-sjalidaza	3.2.1.18	Arthobacter ureafaciens Clostridium perfringens Vibrio cholerae wirus Choroby Newcastle	NeuNAc/NeuGc2-->6 > 3, 8 NeuNAc/NeuGc2-->3, 6, 8 NeuNAc/NeuGc2-->3, 6, 8 NeuNAc/NeuGc2-->3, 8
   -D-galaktozydaza	3.2.1.23	jądra wołu Escherichia coli(Conavalia ensiformis) Streptococcus pneumoniae	Gal1-->3 > 4 > 6 Gal1-->4Glc Gal1-->6 > 4 >> 6 Gal1-->4
   -D-galaktozydaza	3.2.1.22	ziarno kawy	Gal1-->3, 4, 6
   -N-acetylo- -D-heksoaminidaza	3.2.1.30	Canavalia enciformis Streptococcus pneumoniae	Glc(Gal)NAc1-->2, 3, 4, 6
   -N-acetylo-D-heksoaminidaza	3.2.1.49	wątroba kurczaka wątroba z prosiaka	GalNAc1-->
   -D-mannozydaza	3.2.1.24	Canavalia enciformis Asparagillus phoenicins I	Man1-->2, 3, 6 Man1-->2
   -D-mannozydaza	3.2.1.25	Helix pomatia Achatina fulica	Man1-->4
   -L-fukozydaza	3.2.1.51	Charonia lampas nadjądrza wołu migdały I migdały II	Fuc1-->2, 3, 4, 6 Fuc1-->6 > 2, 3, 4 Fuc1-->2 Fuc1-->3, 4
   -D-ksylozydaza		Charonia lampas	Xyl1-->2

   1. Analiza za pomocą kolumn sitowych

   W filtracji oligoglikanów to najczęściej stosuje się miękkie wypełnienia takie jak Bio-Gel P-4 (Bio-Rad) lub Sephadex G-25 (Pharmacja). Bio-Gel P-4 jest stosowany częściej, ponieważ nie zawiera grup cukrowych, które mogłyby interferować z badanym materiałem (Fukuda i Kobata 1993). W połączeniu z hydrolizą enzymatyczną za pomocą egzoglikozydaz i chromatografią na złożach zawierających lektyny metoda ta pozwala na całkowite określenie struktury analizowanych oligosacharydów. Dzieje się tak dlatego, iż każda reszta monosacharydowa w zależności od umiejscowienia w glikanie wpływa w różny sposób na zachowanie się łańcucha podczas chromatografii. Jako standardu służącego do kalibracji kolumny używa się zhydrolizowanego standardu dekstranu przygotowanego poprzez ogrzewanie dekstranu (200 000 Da) 0.1 M HCl przez 4 h w 100^oC. Hydrolizat zawiera liniowe polimery glukozy o różnej długości.
   
   Wadą tej metody jest potrzeba stosowania dużych ilości analizowanego materiału oraz czasochłonność. Pojedynczy rozdział trwa około 6 - 7 dni, a do pełnej charakterystyki oligomeru należy wykonać chromatografie po inkubacji z conajmniej kilkoma glikozydazami.

   2. Analiza W HPLC

   HPLC używane jest przy analizie strukturalnej oligosacharydów do rozdzielania poszczególnych fragmentów węglowodanowych, powstałych np. przez trawienie glikozydazami, od siebie. Dzięki możliwości użycia w stosunku do małych ilości próby, możliwości współdziałania z różnymi rodzajami detekcji i prostocie obsługi technika ta jest najczęściej używaną w analityce. W tej technice kolumny kalibruje się również zhydrolizowanym dekstranem.

   a) HPAEC (DIONEX)

   Chromatografia jonowymienna połączona z pulsacyjną detekcją amperometryczną (PAD) stała się jedną z odmian HPLC najczęściej używanych przy analizie neutralnych mono- i oligosacharydów (Townsend i Hardy 1991). Rozdziału dokonuje się bazując na wiązaniu oksyanionów, powstających w bardzo wysokim pH (pH 12-14), do złoża jonowymiennego. Selektywność uzależniona jest od tego jaka grupa hydroksylowa pochodząca z węglowodanu ulegnie przemianie w oksyanion oraz od zdolności tego oksyanionu do wiązania z grupami aminowymi fazy stałej. Najwięcej oksyanionów powstaje z grup hydroksylowych pochodzących od C-2 w przypadku heksoz i C-3 w przypadku aminocukrów. Jako że O-glikany są niestabilne w wysokich wartościach pH technikę tą stosuje się głównie do N-glikanów. Użycie detektora PAD nie wymaga tworzenia pochodnych analizowanych cukrów. Dzięki tej zalecie technika HPAEC-PAD używana jest do śledzenia reakcji enzymatycznych (Lee 1996). Z powodu właściwości korozyjnych rozpuszczalnika sprzęt do tego rodzaju chromatografii winien być odporny na wysokie wartości pH.
   
   Podczas rozdziału w środowisku silnie zasadowym może zachodzić epimeryzacja i degradacja niezredukowanych wcześniej cukrów. Z tego powodu wielu badaczy poddaje wpierw analizowaną próbę redukcji (Lee 1996). W celu zredukowania stężenia jonów OH^- stosuje się jako eluent dodatek jonów octanowych lub azotanowych.

   b) Normal Phase HPLC

   Chromatografia na tego rodzaju kolumnach używana jest do separacji neutralnych i kwaśnych alditoli O- i N-glikanów (Bregh, Koppen i van den Ejinden 1981). Zarówno dla neutralnych jaki i kwaśnych oligosacharydów czas retencji jest zależny nie tylko od składu oligomeru lecz także od jego struktury przestrzennej. Spośród wielu rodzajów kolumn używa się głównie kolumn krzemianowych z przyłączonymi grupami aminowymi, tzw. kolumn amidowych. W tym rodzaju chromatografii, próbę nanosi się w rozpuszczalniku niepolarnym np. w acetonitrylu lub metanolu, a następnie wypłukuje się ją z kolumny rosnącym gradientem rozpuszczalnika polarnego (np.: słabych roztworów soli w wodzie).

   c) HPLC na odwróconych fazach (RP-HPLC)

   Metoda służy do analizowania N-glikanów na alkalizowanych (np. C₁₈) kolumnach krzemianowych. Jak do tej pory nie ma doniesień o stosowaniu tej techniki do analizowania O-glikanów (Glycobiology 1993 s. 316, edy. Minoru Fokuda i Akira Kobata, Oxford University Press, New York). Jako eluenta niepolarnego używa się acetonitrylu lub metanolu; korzystniej jest używać acetonitrylu, gdyż odczynnik ten wymaga mniejszych stężeń w stosunku do metanolu. W technice tej próbę nanosi się rozpuszczoną w roztworze wodnym, wymywa się rosnącym gradientem CH₃CN.

   3. Elektroforeza

   Technika ta jest stosowana do określania struktury oligosacharydów na zasadzie podobnej jak w przypadku zastosowania kolumn sitowych (wyznaczanie masy oligomerów po enzymatycznej hydrolizie egzoglikozydazami).

   a) w żelu poliakrylamidowym (PAGE)

   Pociętą różnymi egzoglikozydazami próbę oligosacharydu znakuje się fluorescencyjnie przed naniesieniem na żel poliakrylamidowy z SDS. Na żel ten również nanosi się standard otrzymany w wyniku częściowej hydrolizy dekstranu. Po przeprowadzeniu rozdziału żel umieszcza się w skanerze, a odpowiedni program komputerowy dokonuje analizy strukturalnej badanej próby. Żel po rozdziale glikanów można też poddawać blottingowi, a do barwienia cukrów używać biotyny. Metoda ta nie wymaga otrzymania fluoroscencyjnych pochodnych, a zastosowanie specyficznych lektyn pozwala na określenie struktury reszty cukrowej pochodzącej z glikoproteiny (wg. katalogu 1994 firmy Bio-Rad s. 167-169).

   b) kapilarna (CE)

   Metoda odznaczająca się bardzo wysoką czułością w porównaniu z innymi i umożliwiającą analizę śladowych ilości preparatu. Ograniczenia związane są z detekcją określają ilości materiału potrzebnego do próby. Dla detekcji za pomocą promieni UV typowe stężenie preparatu powinno być większe niż 10^-6 M analogicznie dla detekcji elektrochemicznej i fluoroscencyjnej 10^-8 M, by dla fluorescencji indukowanej laserem (LIF) osiągnąć wartość 10^-11 M. Ze względu na fakt, iż dla typowej elektroforezy kapilarnej objętość nanoszonych preparatów jest mniejsza niż 10 m l, w bardzo małych kapilarach istnieje możliwość analizowania prób nawet o stężeniu 40*10^-24M metodą fluorescencji indukowanej laserem (Paulus i Klockow 1996).

   4. Powinowactwo do specyficznych lektyn

   Jednym z największych problemów w analizie grup oligocukrowych jest oddzielenie glikanów od siebie. Można tego dokonać za pomocą wcześniej wymienionych technik jak: HPLC, czy sit molekularnych, jednak rozdział w tych technikach opiera się bardziej na wielkości i ładunku grup oligosacharydowych niż na ich strukturze przestrzennej. Z tego powodu jedną z najczęściej używanych metod do separacji, oczyszczania i analizy glikanów jest chromatografia na złożach zawierających immobilizowane lektyny. Używając lektyn stosunkowo łatwo jest wyizolować izomery strukturalne oligoglikanów.
   
   Klasyfikacja lektyn opiera się na ich wysokim i specyficznym powinowactwie do cukrów i tak wyróżnia się następujące ich rodzaje:

   • mannozowe, galaktozowe i L-fukozowe
   • N-acetyloglukozoaminowe
   • N-acetylogalaktozoaminowe
   • kwasu N-acetyloneuraminowego

   a) Przygotowanie złoża

   Oczyszczone lektyny powinny być związane z nierozpuszczalnym nośnikiem, zwykle używa się w tym celu żelu Sepharose (Pharmacja), będącego pochodną nierozpuszczalnego dekstranu. Proces ten przeprowadza się w obecności odpowiednich cukrów, mających na celu ochronę aktywnej domeny lektyn. Istnieje wiele metod immobilizacji lektyn. Białka te wiąże się z aktywowanymi grupami dekstranu przez najbardziej reaktywne grupy aminokwasów, takie jak aminowe, karboksylowe i sulfhydrylowe. Można też wiązać lektyny przez ich część cukrową.

   b) Postępowanie z immobilizowanymi lektynami

   Zdolność do wiązania lektyn z grupami sacharydowymi zależy w dużej mierze od warunków jakich w dany proces ma miejsce. Wpływają na nią takie zmienne jak na przykład: ilości lektyn na objętość żelu, rozmiar kolumny, temperatura, prędkość przepływu przez kolumnę. Dlatego też kolumny z immobilizowanymi lektynami muszą być stadardyzowane przed użyciem za pomocą oligosacharydów i glikoprotein o określonej już strukturze, aby upewnić się co do ich reaktywności, specyficzności i powtarzalności.
   
   Przy badaniach strukturalnych oligosacharydów stosuje się szereg chromatografii na różnych immobilizowanych, specyficznych lektynach.
   Tabele 5 i 6 przedstawiają specyficzność lektyn wobec niektórych reszt glikozydowych.

   Tabela 5. Struktura oligosacharydów 1--12 i ich zachowanie w lektynowej seryjnej chromatografii powinowactwa; rozmiar kolumny:
   0.7cm * 2.6cm. (Glycobiology 1993 s. 316, edy. Minoru Fokuda i Akira Kobata, Oxford University Press, New York)

   N	Struktura
   	Con A	DSA	E4-PHA (20oC)	E4-PHA (4 oC)	L4-PHA
   1	Man1-6 Gal1-4GlcNAc1-2Man1-3 Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
   	+a	-	-	-	-
   2	Gal1-4GlcNAc1-2Man1-6 Man1-3 Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
   	+	-	-	r	-
   3	Gal1-4GlcNAc1-2Man1-6 Gal1-4GlcNAc1-2Man1-3 Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
   	+	-	-	r	-
   4	Man1-6 Gal1-4GlcNAc13Gal1-4GlcNAc1-2Man1-3 Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
   	+	+b	-	-	-
   5	Gal1-4GlcNAc13Gal1-4GlcNAc1-2Man1-6 Man1-3 Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
   	+	+	-	r	-
   6	GlcNAc1 |   Gal1-4GlcNAc1-2Man1-6 Gal1-4GlcNAc1-2Man1-3 4 Man1 -4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
   	-	-	r	r	-
   7	Gal1-4GlcNAc1-2Man1 6 3 Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn Gal1-4GlcNAc1-2 Gal1-4GlcNAc1-4 Man1
   	-	r	-	r	-
   8	GlcNAc1 |   Gal1-4GlcNAc1-2Man1 6 3 4 Gal1-4GlcNAc1-2 Gal1-4GlcNAc1-4 Man1 Man1 -4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
   	-	r	r	r	-
   9	Gal1-4GlcNAc1-3Gal1-4GlcNAc1-2 Man1 6 3 Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn Gal1-4GlcNAc1-2 Gal1-4GlcNAc1-4 Man1
   	-	+	-	r	-
   10	GlcNAc1 |   Gal1-4GlcNAc1-3Gal1-4GlcNAc1-2 Man1 6 3 4 Gal1-4GlcNAc1-2 Gal1-4GlcNAc1-4 Man1 Man1 -4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn
   	-	+	r	r	-
   11	Gal1-4GlcNAc1-6 Gal1-4GlcNAc1-2 Man1 6 3 Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn Gal1-4GlcNAc1-2 Man1
   	-	+	-	-	r
   12	Gal1-4GlcNAc1-6 Gal1-4GlcNAc1-2 Man1 6 3 Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn Gal1-4GlcNAc1-2 Gal1-4GlcNAc1-4 Man1
   	-	+	-	-	r

   a - wymywane 5mM -metyloglukopiranozą w TB-NaN₃b- wymywane 1% oligomerem N-acetyloglukozoaminy w TB-NaN₃

   Tabela 6. (Glycobiology 1993 s. 249, edy. Minoru Fokuda i Akira Kobata, Oxford University Press, New York)

   Oligosacharyd
   Lektyna	Gęstość wiązania	Hapten
   *Fuc1 |   *NeuAc2-6(3)Gal1-4GlcNAc *NeuAc2-6(3)Gal1-4GlcNAc 1-2Man1-6 1-2Man1-3 Man1 -4GlcNAc1- 6 4GlcNAc -Asn
   Conavalia ensiformis (Con A)	15 mg/ml	-metyloglukoza (10 mM)
   Man1-6 Man1-3 Man1 6 3 Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn *NeuAc2-6(3)Gal1-4GlcNAc1-2Man1
   Conavalia ensiformis (Con A)	15 mg/ml	-metylomannoza (100mM)
   *Man1-2*Man *Man1-2Man 1-6 1-3 Man1 6 3 Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc-Asn *NeuAc2-6(3)Gal1-4GlcNAc 1-2 Man1
   Conavalia ensiformis (Con A)	15 mg/ml	-metylomannoza (100mM)
   *NeuAc2-6(3)Gal1 *NeuAc2-6(3)Gal1   Fuc1 |   -4GlcNAc1-2Man1-6 -4GlcNAc1-2Man1-3 Man1-4GlcNAc1- 6 4GlcNAc - Asn
   Lens culinarisPisum sativum (lektyna z grochu)	15 mg/ml	-metylomannoza (100mM)
   Lens culinarisPisum sativum (lektyna z grochu)	15 mg/ml	-metylomannoza (100mM)
   *Fuc1   *NeuAc2-6(3) *NeuAc2-6(3) Gal1-4GlcNac1-6 Gal1-4GlcNac1-2 Man 1 6 3 Man1-4GlcNAc1- | 6 4GlcNAc -Asn *NeuAc2-6(3) Gal1-4GlcNac1-2Man 1
   Phaseolus volgaris(L4PHA)	10 mg/ml	GalNAc (0.4 M)
   *Fuc1   *NeuAc2-6 *NeuAc2-6 (3)Gal1-4GlcNac1-6 (3)Gal1-4GlcNac1-2 Man1 6 3 Man1-4GlcNAc1- | 6 4GlcNAc -Asn *NeuAc2-6 (3)Gal1-4GlcNac1-2Man1
   Phaseolus volgaris(L4PHA)	10 mg/ml	GalNAc (0.4 M)
   *Fuc1 |   *NeuAc2-6(3)Gal 1-4GlcNAc1-2Man1 6 3 Ma GalNAc1-4 1-4GlcNAc1-2Man1   6     n1-4GlcNAc1- 4GlcNAc -Asn *NeuAc2-6(3)Gal
   Phaseolus volgaris(L4PHA)	10 mg/ml	GalNAc (0.4 M)
   *Fuc1 |   *NeuAc2-6(3) (Gal1-4GlcNAc1-3)n>2Gal1-4GlcNAc 1-2Man1 6 3 Man1-4GlcNAc1- 6 4GlcNAc -Asn *NeuAc2-6(3)Gal1-4GlcNAc1-2Man1
   Phaseolus volgaris(L4PHA)	8 mg/ml	mieszanina N,N"-di-N-acetylochitobiozy i N,N",N""-tri-N-acetylkochitotriozy
   *Fuc1   *NeuAc2-6(3) (Gal1-4GlcNAc1-3)n>2Gal1-4GlcNAc 1-6 Man1 6 3 Man1-4GlcNAc1- | 6 4GlcNAc -Asn *NeuAc2-6(3)Gal1-4GlcNAc1-2 *NeuAc2-6(3)Gal1-4GlcNAc1-2 *NeuAc2-6(3)*Gal1-4GlcNAc1-4 Man1
   Lycopersicon esculentum (lektyna z pomidorów)	8 mg/ml	mieszanina N,N"-di-N-acetylochitobiozy i N,N",N""-tri-N-acetylkochitotriozy
   *Fuc1 |   *NeuAc2-6(3) (Gal1-4GlcNAc1-3)n>2Gal1-4GlcNAc 1-2Man1 6 3 Man1-4GlcNAc1- 6 4GlcNAc -Asn *NeuAc2-6(3)Gal1-4GlcNAc1-2Man1
   Lycopersicon esculentum (lektyna z pomidorów)	15 mg/ml	mieszanina N,N"-di-N-acetylochitobiozy i N,N",N""-tri-N-acetylkochitotriozy
   *Fuc1   *NeuAc2-6(3) (Gal1-4GlcNAc1-3)n>2Gal1-4GlcNAc 1-6 Man1 6 3 Man1-4GlcNAc1- | 6 4GlcNAc -Asn *NeuAc2-6(3)Gal1-4GlcNAc1-2 *NeuAc2-6(3)Gal1-4GlcNAc1-2 *NeuAc2-6(3)*Gal1-4*GlcNAc1-4 Man1 n = 0,1 i >2
   Datura stramonium(DSA)	15 mg/ml	mieszanina N,N"-di-N-acetylochitobiozy i N,N",N""-tri-N-acetylkochitotriozy
   NeuAc2-3Gal1-4GlcNAc1-
   Maackia amurensis (MAL lub MAM)	10 mg/ml	Laktoza (100 mM)
   NeuAc2-3Gal1 -4GlcNAc1-
   Sambucus nigra aglutynina (SNA)	10 mg/ml	Laktoza (100 mM)
   Gal1-3 Gal1-4GlcNAc1-
   Griffonia simplicifolia (I-B4; GS-I-B4)	15 mg/ml	Rafinoza (100 mM)
   GalNAc1-3 Gal1-4GlcNAc1-
   Helix pomatia aglutynina (HPA)	5 mg/ml	GalNAc (10 mM)
   Gal1-4GlcNAc 1-
   Ricinus communis aglutynina (RCA-I)	20 mg/ml	Laktoza (100 mM)
   GalNAc1-4 GlcNAc1-
   Wisteria floribunda aglutynina (WFA)	10 mg/ml	GalNAc (50 mM)
   Fuc | 2 Gal 1-4GlcNAc1-
   Ulex europaesus I (UEA-I)	10 mg/ml	Fuc (100 mM)

   symbol * oznacza +/-

   E. NMR

   Jest to technika pozwalająca na określenie struktury oligosacharydu bez niszczenia próby. Jeżeli widmo nieznanego oligosacharydu jest identyczne z widmem poznanego już związku, to oba związki są takie same. Metoda ta wymaga jednak bardzo drogiego sprzętu o wysokiej jakości. Uważa się, że do analizy cukrów powinno się używać aparatów co najmniej 600 MHz. Technika ta wymaga również wysokiej wiedzy w analizie wyników, gdyż widma różnych substancji są do siebie bardzo podobne. W praktyce nie zawsze istnieje konieczność analizowania całego spektrum. Często wystarczy analiza sygnałów pochodzących z tak zwanych "structural reporter groups" (Vliegenthart i wsp. 1981). Najważniejszymi obszarami widma są: anomeryczny (C1H) od 4.2 do 5.5 ppm i region od 1.0 ppm to 3.0 ppm zawierające rezonansy metylowe.

   1. Rozpuszczalniki

   Aby próbę móc poddać analizie należy ją przenieść do rozpuszczalnika, który nie może zawierać nawet najmniejszych ilości ¹H. Próba musi być wcześniej odsolona. Przy analizie węglowodanów najczęściej używanym rozpuszczalnikiem jest D₂O. Ciężka woda pochodząca od różnych dostawców może się dość znacznie różnić czystością i pH (pD). Dlatego też przed rozpuszczeniem w niej wartościowej próby należy sprawdzić jej właściwości. Korekcji pH dokonuje się za pomocą DCl lub NaOD. Większość widm dla oligo- i monosacharydów wykonuje się w pH neutralnym. Przy obserwacji amidowych grup NH stosuje się obniżone pH (pH 4-5), trzeba jednak bardzo uważać by nie doprowadzić do hydrolizy wiązań glikozydowych, występujących np. w fukozie, czy kwasie neuramidowym. Podczas obserwowania grup hydroksylowych należy próbę schłodzić (nawet do -20°C) by spowolnić proces wymiany H na D (Leeflang i Vliegenthart 1990), aby zapobiec zamarzaniu stosuje się dodatki CD₃COCD₃ (aceton) lub CD₃OD (metanol).

   2. Substancje paramagnetyczne

   Obecność metali paramagnetycznych niekorzystnie wpływa na jakość widma. W celu pozbycia się tych substancji stosuję się kolumnę Chalex (Bio-Rad). Innym sposobem jest dodanie substancji chelatujących np. EDTA; zbyt duże ilości EDTA pogarszają otrzymywane widmo NMR.

   3. Zabezpieczenie przeciwbakteryjne

   Przy używaniu ciężkiej wody jako rozpuszczalnika nie istnieje potrzeba stosowania dodatkowych zabezpieczeń. Jeśli jednak stosuje się bufor fosforanowy to wskazane jest używanie 0,02% roztworu NaN₃.

   4. Temperatura pomiaru

   Utrzymanie stabilnej temperatury jest bardzo ważne, gdyż częstość rezonansu jest zależna od temperatury. W większości pomiarów stosuje się temperaturę 300 K (27^oC). Przy analizowaniu grup hydroksylowych należy utrzymywać temperaturę poniżej 273 K (0^oC).

   5. Probówki do NMR

   Wskazane jest używanie jak najcieńszych próbówek o wysokiej jakości np. Wilmad 528 PP lub 535 PP. Przed użyciem probówki muszą być bardzo starannie umyte i wysuszone. Jeżeli w procesie mycia używało się acetonu to można wykorzystać ten fakt do kalibracji przyrządu, gdyż aceton daje pik w zakresie 2.225 ppm. Nie poleca się używania do mycia kwasu chromowego, gdyż chrom jest pierwiastkiem paramagnetycznym.

   6. Dwuwymiarowy NMR

   W ostatnim dziesięcioleciu rozwinęła się nowa technika NMR - NMR 2-D. Do najważniejszych "podtechnik" tej odmiany NMR należą:

   • HOHAHA
   • COSY
   • NOESY.

   7. Trójwymiarowy NMR

   Technika rzadko wykorzystywana przy analizie węglowodanów. Otrzymuje się ją poprzez połączenie dowolnych dwóch rodzai technik 2-D NMR.

   F. Chromatografia gazowa

   Chromatografia gazowa nadaje się bardziej do ilościowego oznaczania zawartości cukrów niż do określania ich struktury. Dzieje się tak z powodu braku gotowych wzorców w przypadku reszt oligosacharydowych. Gdy jednak dysponuje się glikozydem wzorcowym, to otrzymane widmo może jednoznacznie potwierdzić, czy analizowany cukier jest tej samej struktury.
   
   Aby było możliwe analizowanie węglowodanów za pomocą chromatografii gazowej należy wpierw przeprowadzić je w formy lotne. Dokonuje się tego poprzez metylację i acetylację grup hydroksylowych sacharydu.
   
   Techniki tej można używać do analizowania reszt O-glikozydowych jaki i N-glikozydowych. Wadą jest natomiast niszczenie próby, gdyż detekcji dokonuje się w detektorze płomieniowym. Techniki tej używa się również do określania składu monosacharydowego reszt oligosacharydowych i w tym wypadku jest techniką najczęściej stosowaną. Stosuje się też ją w połączeniu z innymi np.:

   • spektroskopią masową
   • analizą metylacyjną.

   G. Spektroskopia masowa (MS)

   W zależności od techniki jonizacji otrzymuje się informacje o masie molekularnej, w przypadku MALD/MS. Możliwe jest również otrzymanie informacji o strukturze, rodzaju rozgałęzień i wiązań w przypadku FAB-MS dzięki fragmentacji cząsteczki. We wszystkich rodzajach spektroskopii masowej analizowana próba ulega jonizacji za pomocą czynnika jonizującego i zostaje odchylona w zależności od swej masy w polu magnetycznym. Istnieje ścisłe powiązanie masy cząsteczki z odchyleniem od prostoliniowego toru lotu lub z czasem dotarcia do detektora w przypadku spektroskopów TOF.
   
   Jak do tej pory spektroskopia masowa pozwalająca na określenie budowy oligosacharydów była dopełnieniem analizy metylacyjnej. Ostatnio analiza metylacyjna jest jednak techniką coraz rzadziej stosowaną w przygotowaniu preparatów do spektroskopii masowej. Także FAB-MS jest techniką coraz rzadziej używaną w swej pierwotnej postaci. Intensywnie rozwijającą się techniką jest natomiast MALD-MS.

   1. Jonizacja w strumieniu elektronów (EI)

   Metoda jonizacji za pomocą strumienia elektronów, choć stara, bywa nadal powszechnie używana do wykrywania monosacharydów, szczególnie w połączeniu z chromatografią gazową (GC/MS) (Karlsson, Carlstedt i Hansson 1989). W technice tej stosuje się głównie takie pochodne, jak: metylowe, acetylowe i trimetylosilanowe w celu uczynienia próby lotną i termicznie stabilną. Pochodne trimetylosilanowe (TMS) są również użyteczne i w chromatografii cieczowo-gazowej (GLC), chociaż ich widma posiadają wiele pików dla cukrów redukujących w wyniku anomerycznej izomeryzacji i tworzenia postaci zarówno furanozowej, jak i piranozowej.

   a) GC/MS

   Połączenie chromatografii gazowej z spektrometrią masową pozwala na analizę wiązań pomiędzy resztami monosacharydowymi przy wcześniejszej ich metylacji. Jest to metoda od dawna używana do analizy reszt oligosacharydowych i często cytowana wraz z analizą metylacyjną, gdzie w celu zabezpieczenia wszystkich wolnych grup hydroksylowych poddaje się je przekształceniu w grupy metoksy i dalej doprowadza się do hydrolizy oligosacharydu w kwaśnym środowisku. Powstałe wolne monosacharydy są redukowane do alditoli, które są acetylowane na nowo powstałych resztach hydroksylowych. W wyniku jonizacji powstają z monosacharydów serie jonów, które zostały opisane przez Hellerqvist"a (Hellerqvist 1990). Metoda oznaczania anomerii wiązań została omówiona w punkcie odnoszącym się analizy metylacyjnej.

   2. Jonizacja chemiczna (CI)

   Jest to łagodniejsza odmiana jonizacji w stosunku do EI. Poza metodą jonizacji, dalsze oznaczanie jest takie samo jak EI, również i tu wykorzystuje się wcześniejszą metylację i acetylację; dodanie pentafluorobenzyl-p-aminobenzoesanu powoduje zwiększenie czułości i rozdzielczości (Ceasar, Sheeley, Reinhold 1990).

   3. FAB

   Metoda zaprezentowana po raz pierwszy w 1981 roku spowodowała rozszerzenie zakresu mas możliwych do analizowania w procesie spektrometrii masowej EI. W krótkim czasie została metodą wiodącą jeśli chodzi o analizowanie sekwencji i struktury rozgałęzień sacharydów. Jonizacji próby dokonuje się poprzez bombardowanie zawieszonej w glicerolu lub tioglicerolu analizy strumieniem neutralnych atomów, głównie argonu, lub ksenonu. Możliwe jest również użycie w tym celu jonów cezu (Dwek i wsp. 1993). Częściowa jonizacja metylowanej próby pozwala na otrzymanie widma mówiącego o sekwencji i strukturze reszt cukrowych.

   4. MALD-MS

   Technika pozwalająca na otrzymanie widma obrazującego masę białek, glykopeptydów i reszt oligosacharydowych w przeciągu kilkunastu minut. Aby przeprowadzać pomiar nie istnieje potrzeba tworzenia pochodnych oligosacharydów jak ma to miejsce w przypadku FAB-MS. Aby otrzymać widmo analiza jest najpierw mieszana z rozpuszczalnikiem, który zawiera substancję pochłaniającą promieniowanie UV.
   
   Mieszanina substancji pochłaniającej promieniowanie UV i analizy jest krystalizowana, a następnie poddawana we wnętrzu spektrometru masowego TOF pulsacyjnemu wzbudzeniu laserem. Zwykle w tym celu używany jest laser azotowy dający falę o długości 337 nm. Wzbudzony materiał daje jeden pik. Małe stężenia soli obecnych w próbie nie wpływają znacząco na wynik pomiaru. W celu fragmentacji próby poddaje się ją naświetleniu promieniowaniem z zakresu IR, np. otrzymanym dzięki laserowi CO₂ (Martin i wsp 1989).

   5. Electrospray Mas Spectroscopy (ES-MS)

   W technice tej próba wraz z rozpuszczalnikiem jest rozpylana w polu elektrycznym o wysokim potencjale (kilkadziesiąt - kilkaset kV) co powoduje odparowanie rozpuszczalnika i jonizację próby. Z powodu wysokiego stopnia jonizacji stosunek masy do ładunku jest niski. Obecnie ES-MS używana jest do sprawdzania obecności glikozylacji w peptydach i glikopeptydach otrzymanych poprzez trawienie enzymatyczne.

   H. Analiza metylacyjna

   Miejsce wiązania pomiędzy monosacharydami w oligosacharydach może być określone na podstawie analizy metylacyjnej. Metylację wolnych grup hydroksylowych w cukrach uzyskuje się zwykle za pomocą karboanionu soli sodowej metylosulfinylu (Hakamori 1964). Istnieją także doniesienia o używaniu jako odczynnika metylującego karboanionu soli potasowej metylosulfinylu (Philips i Fraser 1981). Zmetylowane oligosacharydy poddaje się kwaśnej hydrolizie. Następnie działaniu NaBH₄ i dalej acylacji bezwodnym kwasem octowym. Otrzymane w ten sposób metylowane monocukry rozdziela się i analizuje za pomocą chromatografii gazowej i spektroskopii masowej.

   1. Określanie anomerii

   Metoda polega na wykorzystaniu zjawiska różnej reaktywności wiązań - i -D-glikozydowych w procesie utleniania za pomocą CrO₃ w środowisku kwasu octowego. Ponieważ wiązanie posiada dwa atomy tlenu umieszczone blisko siebie (pochodzące z pierścienia i wiązania glikozydowego) jest bardziej prawdopodobne, że ulegnie szybciej utlenieniu niż wiązanie . Dalsza analiza polega porównaniu składu sacharydu przed i po procesie utleniania za pomocą GC/MS. Obecność nieprzereagowanych cukrów sugeruje występowanie wiązania -glikozydowego (Hoffman, Lidberg, Svensson 1972).

   III. Wykaz najczęściej używanych skrótów

   ConA-	lektyna z kanawalii mieczoksztaltnej (Canavalia ensiformis)
   D-	deuter
   Da-	dalton
   Fuc-	fukoza
   Gal-	galaktoza
   GalNAc-	N-acetylogalaktozoamina
   Glc-	glukoza
   GlcNAc-	N-acetyloglukozoamina
   HPLC-	High Performance Liquid Chromatography
   HPAEC-	High Performance Anion Exchanege Chromatography
   IR-	promieniowanie podczerwone
   Man-	mannoza
   NeuAc-	kwas N-acetyloneuraminowy
   SDS-	sól sodowa kwasu dodesylosulfonowego
   Xyl-	ksyloza

   IV. Literatura

   1. Bregh M.L.E., Koppen p. i van den Eijnden D.H. (1981) Carbohydr. Res., 94, 225
   2. Ceasar J.P.Jr., Sheeley D.M., Reinhold V.N. (1990) Anal. Biochem., 191, 247
   3. Dwek R.A. i wsp. (1993) Anu. Ev. Biochem., 62, 65
   4. El Rassi Z. i Mechref Y. (1996) Electrophoresis, 17, 275
   5. Endo Y. i Kobata A. (1976) J. Biochem., 80, 1
   6. Fan J.Q., Kadowaki S. i wsp. (1988), Argic. Biol. Chem., 52, 1715
   7. Fukuda M. i Kobata A. Glycobiology a practical approach (1993) Oxford University Press, New York, s. 91-99, s. 140
   8. Hakamori S. (1964) J. Biochem. (Tokyo), 55, 205
   9. Harris R.H. i Spellman M.W. Glycobiology, 3, 219
   10. Hellerqvist C.G. (1990) Methods Enzymol., 193, 554
   11. Hoffman J., Lidberg B., Svensson S. (1972)
   12. Iwase H. i wsp. (1988) Biochem. Biophys. Res. Comm., 151, 422
   13. Kakehi K. i wsp. (1994) J. Chromatogr. A, 680, 209
   14. Karlsson H., Carlstedt I. I Hansson G.C. (1989) Anal. Biochem., 182, 438
   15. Kłyszejko-Stefanowicz L. Cytobiochemia (1995), Wydawnictwa Naukowe PWN, Warszawa, s. 648
   16. Kobata A. (1992) Eur. J. Biochem., 209, 483
   17. Kobata A. (1994) katalog firmy Oxford GlycoSystems 1994, 3
   18. Krotkiewski H. (1982) Postępy Bioch., 28, 433
   19. Lee Y.C. (1996) J. Chromatogr. A, 720, 137
   20. Leeflang B.R. i Viegenthart J.F.G. (1990) J. Mag. Reson., 89, 615
   21. Leurage P. i Faye L. (1996) Plant Physiol. Biochem., 34 (2), 263.
   22. Likhosherstow i wps. (1990) Carbohydr. REs., 178, 155
   23. Lisman J.J.W i wsp. (1985) Biochem. J., 229, 379
   24. Maley F. i wsp. (1989) Jr., Anal. Biochem., 180, 195
   25. Maramatsu T. (1971) Journal of Chromatography, 246, 5535
   26. Maramatsu T. (1988) Meth. Enzymol., 50, 555
   27. Martin W.B. i wsp. (1989) Int. J. Mass Spektrom. Ion Proc., 92, 243
   28. O"Neill R.A. (1996) Journal of Chromatography A, 720, 201
   29. Ogawa H. i wsp. (1996) Glycoconjugate Jurnal 13, 555
   30. Patel T i wsp. (1993) Biochemistry, 32, 679
   31. Paulus A. i Klockow A (1996) Journal of Chromatography A, 720, 353
   32. Philips L.R. i Fraser B.A. (1981) Carbohydr. Res., 90, 149
   33. Plumer T.H. i wsp. (1981) J. Biol. Chem., 256, 10243
   34. Schacter H. (1986) Biochem. Cell. Biol., 64, 163
   35. Schacter H. (1994) katalog firmy Oxford GlycoSystems 1994, 9
   36. Stryer L., Biochemistry - czwarta edycja, (1995) W.H. Freeman and Company, New York, s. 56-57
   37. Tachibana Y., Yamashita K. i Kobata A. (1982) Biochem. Biophys., 214, 379
   38. Taga E.M. i wsp. (1984) Biochemistry, 23, 815
   39. Taverna M i wsp. (1995) Biomed. Chromatogr. B, 657, 315
   40. Townsend R.R. i Hardy M.R. (1991) Glycobiology, 1, 139
   41. Trimble R.B. i Tarentino A.L. (1991) J. Biol. Chem., 266, 1646
   42. Trimble R.B. i wsp. (1986) J. Biol. Chem., 261, 12000

   ---

   Praca wpłynęła na Chemfan: 12-06-1999