Część doświadczalna

Materiały i metody.

Syntezę i modyfikację oligonukleotydów przeprowadzałem na zaprojektowanym i wykonanym w Pracowni Syntezy DNA IChB PAN w Poznaniu automatycznym syntetyzerze DNA. Oligonukleotydy analizowane i oczyszczane były na żelu poliakrylamidowym denaturującym (19% akrylamid, 1% N,N'-metylenobisakrylamid, 7M mocznik). Wizualizację oligomerów uzyskiwano poprzez umieszczenie żelu na płycie z fluoroforem i oświetlenie lampą UV 254 nm. Oligomery zawierające grupy fluoryzujące wizualizowano poprzez oświetlenie lampą UV 366 nm.
Pirydyna (Lab Scan) i acetonitryl (Merck) były przechowywane nad sitami molekularnymi 4A, aż zawartość wody obniżała się poniżej 20 ppm (miareczkowanie kulometryczne Karla-Fischera na kulometrze Metrohm 684 KF). Chlorek piwaloilu (Merck), 2-aminoetanol (Fluka), 3-aminopropan-1-ol (Aldrich) i glikol etylenowy (POCh) były przedestylowane przed użyciem. Trietyloamina (Loba) była przedestylowana i przechowywana nad wodorkiem wapnia (Fluka). Kwas fosforawy (Fluka), fosforyn dietylowy (Aldrich), fosforyn difenylowy (Aldrich), 4-aminobutan-1-ol (Merck), 5-amino-pentan-1-ol (Fluka), 6-aminoheksan-1-ol (Aldrich), 1,3-propanodiol (Fluka), 1,4-butanodiol (Fluka), 1,5-pentanodiol (Fluka), 1,6-heksanodiol (Fluka), jod (Merck), akrylonitryl (Loba) były używane bez oczyszczania. Etanol (POCh) był osuszony wg standardowej metody¹⁴⁸ i przechowywany nad sitami molekularnymi 3A. n-Butyloamina (Fluka) osuszana była za pomocą KOH, następnie destylowana i przechowywana nad sitami molekularnymi 3A. H-Fosfonian 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowy 121¹⁴⁹, H-fosfonian etylowo - 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowy 146¹²⁰, H-fosfonian 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 3'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-5'-ylowy 147¹⁵⁰, H-fosfonian 2-cyjanoetylowo - 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowy 148¹²⁰, H-fosfonian p-chlorofenylowo - 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowy 173¹⁴⁹ i 2-chloro-5,5-dimetylo-2-okso-1,3,2-dioksafosfinan (NEP-Cl) 133¹²² były przygotowane wg opublikowanych procedur.
Związki 134, 142, 143a, 163-165, 174 były nietrwałe, co uniemożliwiało ich oczyszczenie za pomocą chromatografii kolumnowej. Ich strukturę chemiczną wywnioskowałem z danych ³¹P NMR oraz przez porównanie ze zwⁱązkami 134, 163, 164 i 174 zsyntetyzowanymi in situ poprzez kondensację odpowiedniego monoestru z butyloaminą lub aminoalkoholami 124a - c i e wobec NEP-Cl¹³⁴. H-Fosfonodiestry były utleniane i izolowane jako stabilne fosforanodiestry. Związki referencyjne typu 165 otrzymane były poprzez transestryfikację¹⁵¹ H-fosfonianu difenylowego odpowiednimi aminoalkoholami.
Odparowywanie rozpuszczalników przed i po reakcjach przeprowadzane było zawsze pod zmniejszonym ciśnieniem.
Przesunięcia chemiczne i stałe sprzężeń ³¹P NMR produktów pośrednich i końcowych zestawiono w Tabeli 13 (str. *).

Otrzymywanie kwasu pirofosfonowego 120.
Kwas fosforawy (4 mM) odparowano z pirydyną, rozpuszczono w tym samym rozpuszczalniku (10 ml) i dodano NEP-Cl lub chlorek piwaloilu (0,55 ekw.). Produkt 120 używano w postaci roztworu pirydynowego, w którym związek ten był trwały co najmniej trzy miesiące.

Ogólna procedura syntezy fosforodiestrów nukleozydowo - N-piwaloiloaminoalkilowych typu 126.
H-Fosfonian 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowy121 (sól trietyloamoniowa) i odpowiedni aminoalkohol (1 ekw.) wysuszono przez odparowanie z nadmiarem pirydyny i rozpuszczono w tym samym rozpuszczalniku (1 mmol / 5 ml) a następnie dodano chlorek piwaloilu (2,5 ekw.). Po ok. 10' (TLC, faza A) dodano wodę (5%) i jod (1,05 ekw.). Utlenianie prowadzono przez 20'. Nadmiar jodu rozłożono etanotiolem i odparowano rozpuszczalniki. Pozostały olej rozpuszczono w chlorku metylenu, przemyto NaHCO_{3 aq. sat.}, fazę organiczną osuszono nad bezwodnym Na₂SO₄ i odparowano do sucha. Związki typu 126 izolowano za pomocą chromatografii krótkokolumnowej stosując liniowy gradient metanolu w chlorku metylenu zawierającym 5% Et₃N. Frakcje zawierające czyste produkty odparowano, pozostałość rozpuszczono w chlorku metylenu i strącono nadmiarem heksanu - eteru dietylowego 1:1, po czym odsączono i wysuszono w próżni.

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 2-(piwaloiloamino)etylowy 126a ^. Et₃NH⁺. Wydajność 87%. A. E.: C: 62,1%, H: 7,1%, N: 6,1%, P: 3,6%; C₄₄H₆₁N₄O₁₁P zawiera C: 62,0%, H: 7,2%, N: 6,6%, P: 3,6%. R_f: 0,47 (faza C), 0,59 (faza D). ¹H NMR, d_H (CDCl₃): 1,17 [9H, s, C(CH₃)₃], 1,31 [9H, t, J 7,3, N(CH₂CH₃)₃], 1,35 (3H, s, 5-CH₃), 2,33 i 2,62 (2H, 2 m, 2'-H₂), 3,03 [6H, q, J 7,3, N(CH₂CH₃)₃], 3,38 (2H, m, CH₂CH₂NH), 3,49 (2H, m, 5'-H₂), 3,78 (6H, s, OCH₃), 3,89 (2H, m, POCH₂), 4,31 (1H, m, 4'-H), 4,98 (1H, m, 3'-H), 6,43 (1H, m, 1'-H), 6,82 (4H, d, J 8,9, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,24-7,37 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,61 (1H, s, 6-H) i 8,84 (1H, br s, N³H, wymiana z D₂O).

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 3-(piwaloiloamino)propylowy 126b ^. Et₃NH⁺. Wydajność 84%. S. M.: MH⁺: 867, (MH+ - Et₃NH⁺)Na⁺: 788, (M - Et₃NH⁺)2Na⁺: 810; C₄₅H₆₃N₄O₁₁P ma MH⁺: 867. R_f: 0,52 (faza C), 0,59 (faza D). ¹H NMR, d_H (CDCl₃): 1,17 [9H, s, C(CH₃)₃], 1,32 (3H, s, 5-CH₃), 1,32 [9H, t, J 7,3, N(CH₂CH₃)₃], 1,70 (2H, dt, J 5,8, CH₂CH₂CH₂), 2,35 i 2,66 (2H, 2 m, 2'-H₂), 3,05 [6H, q, J 7,3, N(CH₂CH₃)₃], 3,37 (2H, m, CH₂CH₂NH), 3,49 (2H, m, 5'-H₂), 3,78 (6H, s, OCH₃), 3,86 (2H, m, POCH₂), 4,31 (1H, m, 4'-H), 4,97 (1H, m, 3'-H), 6,43 (1H, m, 1'-H), 6,88 (4H, d, J 8,7, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,25-7,39 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,62 (1H, s, 6-H) i 8,86 (1H, br s, N³H, wymiana z D₂O).

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 6-(piwaloiloamino)heksylowy 126e ^. Et₃NH⁺. Wydajność 72%. A. E.: C: 63,0%, H: 7,5%, N: 6,0%, P: 3,4%; C₄₈H₆₉N₄O₁₁P zawiera C: 63,4%, H: 7,6%, N: 6,2%, P: 3,4%. R_f: 0,52 (faza C), 0,59 (faza D). ¹H NMR, d_H (CDCl₃): 1,18 [9H, s, C(CH₃)₃], 1,32 (3H, s, 5-CH₃), 1,32 [9H, t, J 7,2, N(CH₂CH₃)₃], 1,32 (4H, m, OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂NH), 1,45 (2H, dt, J 6,9, CH₂CH₂CH₂NH), 1,57 (2H, dt, J 6,9, POCH₂CH₂CH₂), 2,35 i 2,66 (2H, 2 m, 2'-H₂), 3,04 [6H, q, J 7,3, N(CH₂CH₃)₃], 3,19 (2H, dt, J 6,6 i 6,9, CH₂CH₂NH), 3,37 (2H, m, CH₂CH₂NH), 3,40 (2H, m, 5'-H₂), 3,78 (6H, s, OCH₃), 3,80 (2H, m, POCH₂), 4,32 (1H, m, 4'-H), 5,78 (1H, m, 3'-H), 6,45 (1H, m, 1'-H), 6,82 (4H, d, J 8,9, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,24-7,40 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,61 (1H, s, 6-H) i 8,91 (1H, br s, N³H, wymiana z D₂O).

Synteza 2-[5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-yloksy]-2-okso-1,3,2-oksazaperhydrofosforinu 129b.

A. Metoda z preaktywacją H-fosfonianu nukleozydu 121.
Roztwór H-fosfonianu 121 w pirydynie (1 mmol/5 ml) aktywowano chlorkiem piwaloilu (2,5 ekw.). Następnie dodano 3-aminopropan-1-ol 124b (1,1 ekw.) i po 5' dodano jodu (1,05 ekw.). Po 15' nadmiar jodu rozłożono etanotiolem, odparowano rozpuszczalnik a pozostałość rozpuszczono w chlorku metylenu i przemyto NaHCO_{3 aq. sat.}. Fazę organiczną osuszono nad bezwodnym Na₂SO₄ i odparowano do sucha. Związek 130 oczyszczono za pomocą chromatografii krótkokolumnowej stosując liniowy gradient metanolu w chlorku metylenu. Frakcje zawierające czyste produkty odparowano, pozostałość rozpuszczono w chlorku metylenu i strącono nadmiarem heksanu - eteru dietylowego 1:1. Osad odsączono i wysuszono w próżni. Wydajność 69%. S. M.: MH⁺: 664, (MNa)⁺: 686, (M - H⁺)2Na⁺: 708; C₃₄H₃₈N₃O₉P ma MH⁺: 664. R_f(dwa diastereoizomery): 0,58 i 0,62 (faza A), 0,58 i 0,66 (faza B₂). ¹H NMR, d_H (CDCl₃): 1,73 (3H, s, 5-CH₃), 1,65 i 2,00 (2H, 2m, CH₂CH₂CH₂), 2,43 i 2,65 (2H, 2 m, 2'-H₂), 3,18 i 3,25 (2H, 2m, PNHCH₂), 3,41 i 3,51 (2H, 2m, 5'-H₂), 3,79 (6H, s, OCH₃), 4,18 i 4,29 (2H, 2m, POCH₂), 4,29 (1H, m, 4'-H), 5,12 (1H, m, 3'-H), 6,47 (1H, m, 1'-H), 6,83 (4H, d, J 8,7, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,24-7,39 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,57 (1H, br s, 6-H) i 8,81 (1H, br s, N³H, wymiana z D₂O).

B. Kondensacja wobec NEP-Cl.
H-Fosfonian 121 i 3-aminopropan-1-ol 124b (1,05 ekw.) w pirydynie (1 mmol/5 ml) traktowano chlorofosforanem 136 (2,5 ekw.) przez 10'. Następnie do roztworu dodano wody do stężenia 5% i mieszaninę utleniano jodem (1,05 ekw.) przez 15'. Dalszy przerób j.w. w metodzie A. Wydajność 66%. S. M.: MH⁺: 769, (MH⁺ - Et₃NH⁺)Na⁺: 690, (M - Et₃NH⁺)2Na⁺: 712; C₃₉H₅₃N₄O₁₀P ma MH⁺: 769. R_f: 0,22 (faza C), 0,37 (faza D). ¹H NMR, d_H (CDCl₃): 1,30 [9H, t, J 7,3, N(CH₂CH₃)₃] 1,34 (3H, s, 5-CH₃), 2,35 i 2,66 (2H, 2 m, 2'-H₂), 2,85 (2H, m, PNHCH₂), 3,04 [6H, q, J 7,3, N(CH₂CH₃)₃], 3,49 (2H, m, 5'-H₂), 3,53 (2H, m, CH₂OH), 3,77 (6H, s, OCH₃), 4,24 (1H, m, 4'-H), 4,91 (1H, m, 3'-H), 6,36 (1H, m, 1'-H), 6,82 (4H, d, J 8,7, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,25-7,41 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,62 (1H, s, 6-H).

Synteza 2-[5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-yloksy]-2-okso-1,3,2-oksazaperhydrofosfepinu 129c.
Reakcję przeprowadzano analogicznie do opisanej wyżej syntezy związku 129b (podejście B), z tą różnicą, że użyto 4-aminobutan-1-ol 124c zamiast 3-aminopropan-1-olu 124b. Wydajność 53%. S. M.: MH⁺: 678, (MNa)⁺: 700, (M - H⁺)2Na⁺: 722; C₃₅H₄₀N₃O₉P ma MH⁺: 678. R_f (dwa diastereoizomery): 0,53 i 0,58 (faza A), 0,58 i 0,66 (faza B₂). ¹H NMR, d_H (CDCl₃): 1,65 (3H, s, 5-CH₃), 1,66 i 1,82 (4H, 2m, CH₂CH₂CH₂CH₂), 2,40 i 2,63 (2H, 2m, 2'-H₂), 2,91 i 3,00 (2H, 2m, PNHCH₂), 3,40 i 3,51 (2H, 2m, 5'-H₂), 3,79 (6H, s, OCH₃), 4,10 (1H, m, 4'-H), 4,08 i 4,20 (2H, 2m, POCH₂), 5,17 (1H, m, 3'-H), 6,45 (1H, dt, J 5,6, 1'-H), 6,83 (4H, d, J 8,7, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,23-7,39 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,58 (1H, br s, 6-H) i 8,50 (1H, br s, N³H, wymiana z D₂O).

Synteza amidofosforanu 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylo - N-(2-hydroksyetylowego) 130^. Et₃NH⁺.

A. Metoda z preaktywacją związku 121.
Reakcję przeprowadzano analogicznie do opisanej wyżej syntezy perhydrofosforinu 129b (metoda A), z tą różnicą, że użyto 2-aminoetanol 124a zamiast 3-aminopropan-1-olu124b, a utlenianie prowadzono w obecności wody (0,5%). Produkt 130 oczyszczono za pomocą chromatografii krótkokolumnowej stosując liniowy gradient metanolu w chlorku metylenu zawierającym 5% Et₃N. Wydajność 57%.

B. Kondensacja wobec NEP-Cl.
Reakcję przeprowadzano analogicznie do opisanej wyżej syntezy perhydrofosforinu 129b (metoda B), z tą różnicą, że użyto 2-aminoetanol 124a zamiast 3-aminopropan-1-olu124b. Oczyszczanie jw. Wydajność 69%. S. M.: MH⁺: 769, (MH⁺ - Et₃NH⁺)Na⁺: 690, (M - Et₃NH⁺)2Na⁺: 712; C₃₉H₅₃N₄O₁₀P ma MH⁺: 769. R_f: 0,22 (faza C), 0,37 (faza D). ¹H NMR, d_H (CDCl₃): 1,30 [9H, t, J 7,3, N(CH₂CH₃)₃] 1,34 (3H, s, 5-CH₃), 2,35 i 2,66 (2H, 2 m, 2'-H₂), 2,85 (2H, m, PNHCH₂), 3,04 [6H, q, J 7,3, N(CH₂CH₃)₃], 3,49 (2H, m, 5'-H₂), 3,53 (2H, m, CH₂OH), 3,77 (6H, s, OCH₃), 4,24 (1H, m, 4'-H), 4,91 (1H, m, 3'-H), 6,36 (1H, m, 1'-H), 6,82 (4H, d, J 8,7, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,25-7,41 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,62 (1H, s, 6-H).

Ogólna procedura syntezy fosforodiestrów nukleozydowo - aminoalkilowych 132b-e(metoda z wolnymi aminoalkoholami).
Odpowiednie diestry 134b-e otrzymano analogicznie do opisanej wyżej syntezy związku 130 (metoda B). Po utlenieniu i rozłożeniu nadmiaru jodu etanotiolem, do mieszaniny reakcyjnej dodano NaHCO_{3 aq. sat.} aby zneutralizować kwaśne składniki powstałe w toku reakcji. Rozpuszczalnik odparowano do gęstego oleju i rozpuszczono w minimalnej objętości chlorku metylenu zawierającego 5% Et₃N. Nierozpuszczone sole nieorganiczne odsączono, a roztwór naniesiono na kolumnę zawierającą żel krzemionkowy. Rozdział przeprowadzono analogicznie jak dla związków typu 126.

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 3-aminopropylowy 132b ^.Et₃NH⁺. Wydajność 73%. S. M.: MH⁺: 682, (MNa⁺: 704, (M - H⁺)2Na⁺: 726; C₃₄H₄₀N₃O₁₀P ma MH⁺: 682. R_f: 0,02 (faza C), 0,18 (faza D). ¹H NMR, d_H (CDCl₃): 1,32 (3H, s, 5-CH₃), 1,88 (2H, m, POCH₂CH₂), 2,27 i 2,62 (2H, 2 m, 2'-H₂), 3,02 (2H, m, CH₂NH₃⁺), 3,33 (2H, m, 5'-H₂), 3,72 (6H, s, OCH₃), 3,89 (2H, 2m, POCH₂), 4,20 (1H, m, 4'-H), 4,88 (1H, m, 3'-H), 6,27 (1H, m, 1'-H), 6,78 (4H, d, J 9,0, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,18-7,35 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,53 (1H, br s, 6-H).

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 4-aminobutylowy 132c ^.Et₃NH⁺. Wydajność 62%. S. M.: MH⁺: 696, (MNa⁺: 718, (M - H⁺)2Na⁺: 740; C₃₅H₄₂N₃O₁₀P ma MH⁺: 696. R_f: 0,03 (faza C), 0,15 (faza D). ¹H NMR, d_H (CDCl₃): 1,35 (3H, s, 5-CH₃), 1,62 (2H, m, CH₂CH₂NH₃⁺), 1,79 (2H, m, POCH₂CH₂), 2,25 i 2,66 (2H, 2 m, 2'-H₂), 2,90 (2H, m, CH₂NH₃⁺), 3,30 (2H, m, 5'-H₂), 3,72 (6H, s, OCH₃), 3,79 (2H, 2m, POCH₂), 4,23 (1H, m, 4'-H), 4,89 (1H, m, 3'-H), 6,29 (1H, m, 1'-H), 6,79 (4H, d, J 8,7, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,20-7,36 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,55 (1H, br s, 6-H) i 8,30 (1H, br s, N³H, wymiana z D₂O).

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 5-aminopentylowy 132d ^.Et₃NH⁺. Wydajność 78%. S. M.: MH⁺: 710, (MNa⁺: 732, (M - H⁺)2Na⁺: 754; C₃₆H₄₄N₃O₁₀P ma MH⁺: 710. R_f: 0,02 (faza C), 0,16 (faza D). ¹H NMR, d_H (CDCl₃): 1,40 (3H, s, 5-CH₃), 1,51 (2H, m, CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂), 1,59 (2H, m, CH₂CH₂NH₃⁺), 1,71 (2H, m, POCH₂CH₂), 2,20 i 2,62 (2H, 2 m, 2'-H₂), 2,98 (2H, m, CH₂NH₃⁺), 3,34 (2H, m, 5'-H₂), 3,75 (6H, s, OCH₃), 3,79 (2H, 2m, POCH₂), 4,25 (1H, m, 4'-H), 4,93 (1H, m, 3'-H), 6,29 (1H, m, 1'-H), 6,81 (4H, d, J 8,8, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,23-7,37 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,51 (1H, br s, 6-H) i 8,38 (1H, br s, N³H, wymiana z D₂O).

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 6-aminoheksylowy 132e^.Et₃NH⁺. Wydajność 69%. S. M.: MH⁺: 724, (MNa⁺: 746, (M - H⁺)2Na⁺: 768; C₃₇H₄₆N₃O₁₀P ma MH⁺: 724. R_f: 0,05 (faza C), 0,19 (faza D). ¹H NMR, d_H (CDCl₃): 1,32 (4H, m, CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂), 1,33 (3H, s, 5-CH₃), 1,54 (2H, m, CH₂CH₂NH₃⁺), 1,67 (2H, m, POCH₂CH₂), 2,23 i 2,63 (2H, 2 m, 2'-H₂), 2,86 (2H, m, CH₂NH₃⁺), 3,30 (2H, m, 5'-H₂), 3,70 (2H, 2m, POCH₂), 3,73 (6H, s, OCH₃), 4,24 (1H, m, 4'-H), 4,93 (1H, m, 3'-H), 6,34 (1H, m, 1'-H), 6,80 (4H, d, J 8,7, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,24-7,35 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,57 (1H, br s, 6-H) i 8,33 (1H, br s, N³H, wymiana z D₂O).

Ogólna procedura syntezy fosforodiestrów nukleozydowo - aminoalkilowych 132a-e (metoda z preacylacją aminoalkoholi).
Odpowiedni aminoalkohol 124a-e (1,1 ekw.) potraktowano TFAA (1,1 ekw.) w pirydynie (aminoalkoholu). Do mieszaniny reakcyjnej dodano roztwór H-fosfonianu 121 w minimalnej ilości pirydyny, a następnie chlorek piwaloilu (3,0 ekw.). Po 10' dodano roztwór jodu (1,05 ekw.) w 20% wodnej pirydynie (5 ml/1 mmol H-fosfonianu 121). Po 15' rozłożono nadmiar jodu etanotiolem i zatężono roztwór do oleju, który następnie rozpuszczono w pirydynie (5ml/1 mmol H-fosfonianu 121) i dodano równą objętość 25% wodnego amoniaku. Reakcję pozostawiono na noc w temp. pok. Izolację fosforodiestrów 132a-e przeprowadzono tak, jak opisano powyżej dla 132b-e.

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 2-aminoetylowy 132a^.Et₃NH⁺. Wydajność 88%. S. M.: MH^{+: 668, (MNa+: 690, (M - H+)2Na+: 712; C₃₄H₄₀N₃O₁₀P ma MH+: 668. R_f: 0,07 (faza C), 0,29 (faza D). 1H NMR,} d_H (CDCl₃): 1,31 (3H, s, 5-CH₃), 2,25 i 2,67 (2H, 2 m, 2'-H₂), 3,11 (2H, m, CH₂NH₃⁺), 3,31 (2H, m, 5'-H₂), 3,69 (6H, s, OCH₃), 4,03 (2H, 2m, POCH₂), 4,20 (1H, m, 4'-H), 4,85 (1H, m, 3'-H), 6,20 (1H, m, 1'-H), 6,76 (4H, d, J 8,1, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,20-7,33 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,51 (1H, s, 6-H) i 8,06 (1H, br s, N³H, wymiana z D₂O).

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 3-aminopropylowy 132b ^. Et₃NH⁺. Wydajność 82%. Dane spektralne i analityczne jw.

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 4-aminobutylowy 132c ^. Et₃NH⁺. Wydajność 73%. Dane spektralne i analityczne jw.

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 5-aminopentylowy 132d ^. Et₃NH⁺. Wydajność 81%. Dane spektralne i analityczne jw.

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 6-aminoheksylowy 132e ^. Et₃NH⁺. Wydajność 80%. Dane spektralne i analityczne jw.

Synteza fosforanu 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-5'-ylowo - 6-aminoheksylowego 132e ^. Et₃NH⁺(metoda z kondensacją oksydatywną).
Mieszaninę diestru H-fosfonianowego 152 i tetrazolu (4 ekw.) oraz chlorowodorek 6-aminoheksan-1-olu 153e(10 ekw.) osuszonoosobno przez odparowanie z pirydyną. H-Fosfonian z tetrazolem rozpuszczono następnie w pirydynie (2 mmol 152 / ml) i dodano równocześnie chlorowodorek aminoalkoholu 153e w pirydynie (20 mmoli / ml) i jod (1,05 ekw.). Po zakończeniu reakcji syntezy triestru 155 (10') nadmiar jodu rozłożono etanotiolem, odparowano pirydynę, pozostały olej rozpuszczono w chlorku metylenu, przemyto NaHCO_{3 aq. sat.} i osuszono nad Na₂SO₄ bzw. Rozpuszczalnik odparowano, a pozostałość rozpuszczono w pirydynie. Do roztworu dodano równą objętość 25% NH_{3 aq.} i pozostawiono na noc w temp. pok. Roztwór następnie odparowano, a izolację fosforodiestru 132eprzeprowadzono tak, jak opisano na str. *. Wydajność 46%. Dane spektralne jak na str. *.

Synteza 2-[5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)-tymidyn-3'-yloksy]-1,3,2-dioksafosfolanu 137a.
Roztwór H-fosfonianu 121 w pirydynie (1 mmol/5 ml) potraktowano chlorkiem piwaloilu (2,5 ekw.). Następnie dodano etanodiol 136a (1,1 ekw.), po 5' odparowano rozpuszczalnik, a pozostałość rozpuszczono w chlorku metylenu i przemyto krótko NaHCO_{3 aq. sat.}. Fazę organiczną osuszono nad bezwodnym Na_2SO4 i odparowano do sucha. Związek 137a oczyszczono za pomocą chromatografii krótkokolumnowej stosując 0,5% metanolu w chlorku metylenu. Frakcje zawierające czyste produkty odparowano, pozostałość rozpuszczono w chlorku metylenu i strącono w układzie heksan - eter dietylowy 1:1. Precypitat odfiltrowano i wysuszono w próżni. Wydajność 43%. R_f : 1,45 (faza B₁). ¹H NMR, d_H (CDCl₃): 1,71 (3H, s, 5-CH₃), 2,47 i 2,66 (2H, 2 m, 2'-H₂), 3,40 i 3,47 (2H, 2m, 5'-H₂), 3,81 (6H, s, OCH₃), 4,22 (2H, m, POCH₂), 4,31 (1H, m, 4'-H), 5,08 (1H, m, 3'-H), 6,50 (1H, m, 1'-H), 6,82 (4H, d, J 8,7, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,20-7,37 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,58 (1H, br s, 6-H) i 8,70 (1H, br s, N³H, wymiana z D₂O).

Ogólna procedura otrzymywania cyklicznych fosforanów typu 139.

A. Metoda z preaktywacją związku 121.

Reakcje przeprowadzano analogicznie do opisanej wyżej syntezy związku 129b (podejścia A i B), z tą różnicą, że używano dioli 136b - 136d zamiast 3-aminopropan-1-olu 124b.

2-[5'-O-(4,4'-Dimetoksytrytylo)-tymidyn-3'-yloksy]-2-okso-1,3,2-dioksafosfinan 139b. Wydajność 63% (metoda A); 58% (metoda B). S. M.: MH⁺: 665, M⁺: 664; C₃₄H₃₇N₂O₁₀P ma MH⁺: 665. R_f: 1,33 (faza A), 1,38 (faza B₂). 1H NMR, d _H (CDCl₃): 1,46 (3H, s, 5-CH₃), 1,70 i 2,20 (2H, 2m, CH₂CH₂CH₂), 2,50 i 2,66 (2H, 2 m, 2'-H₂), 3,49 (2H, m, 5'-H₂), 3,75 (6H, s, OCH₃), 4,29 (2H, m, POCH₂), 4,33 (1H, m, 4'-H), 5,26 (1H, m, 3'-H), 6,56 (1H, m, 1'-H), 6,85 (4H, d, J 8,7, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,23-7,44 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,57 (1H, br s, 6-H) i 8,60 (1H, br s, N³H, wymiana z D₂O).

2-[5'-O-(4,4'-Dimetoksytrytylo)-tymidyn-3'-yloksy]-2-okso-1,3,2-dioksafosfepan 139c. Wydajność 61% (metoda A); 68% (metoda B). S. M.: MH⁺: 680, M⁺: 679; C₃₅H₃₉N₂O₁₀P ma MH⁺: 680. R_f: 1,34 (faza A), 1,39 (faza B₂). 1H NMR, d _H (CDCl₃): 1,41 (3H, s, 5-CH₃), 1,89 (4H, m, CH₂CH₂CH₂CH₂), 2,43 i 2,62 (2H, 2m, 2'-H₂), 3,47 (2H, m, 5'-H₂), 3,76 (6H, s, OCH₃), 4,13 (4H, m, POCH₂), 4,30 (1H, m, 4'-H), 5,30 (1H, m, 3'-H), 6,54 (1H, m, 1'-H), 6,84 (4H, d, J 8,1, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,27-7,42 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,57 (1H, br s, 6-H) i 8,61 (1H, br s, N³H, wymiana z D₂O).

2-[5'-O-(4,4'-Dimetoksytrytylo)-tymidyn-3'-yloksy]-2-okso-1,3,2-dioksafosfokan 139d. Wydajność 52% (metoda A); 45% (metoda B). S. M.: MH⁺: 694, M⁺: 693; C₃₆H₄₁N₂O₁₀P ma MH⁺: 694. R_f: 1,34 (faza A), 1,38 (faza B₂). 1H NMR, d _H (CDCl₃): 1,41 (3H, s, 5-CH₃), 1,73 (4H, m, POCH₂CH₂), 1,90 (2H, m, POCH₂CH₂CH₂), 2,40 i 2,65 (2H, 2m, 2'-H₂), 3,46 (2H, m, 5'-H₂), 3,78 (6H, s, OCH₃), 4,06 (4H, m, POCH₂), 4,29 (1H, m, 4'-H), 5,22 (1H, m, 3'-H), 6,51 (1H, m, 1'-H), 6,84 (4H, d, J 9,0, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,26-7,41 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,56 (1H, br s, 6-H) i 8,61 (1H, br s, N³H, wymiana z D₂O).

Synteza fosforanu 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylo - 2-hydroksyetylowego 141a^. Et₃NH⁺.
Reakcję przeprowadzono analogicznie do opisanej wyżej syntezy amidofosforanu 130 (metoda A), z tą różnicą, że użyto glikolu etylenowego 136a zamiast 2-aminoetanolu 124a, a utlenianie prowadzono wobec 1,5 ekw. wody, a po zakończeniu utleniania ilość wody zwiększono do 10% v/v. Wydajność 41%. S. M.: MH⁺: 770, (MH⁺ - Et₃N): 668; C₃₉H₅₂N₃O₁₁P ma MH⁺: 770. R_f: 0,31 (faza C), 0,41 (faza D). ¹H NMR, d_H (CDCl₃): 1,31 [9H, t, J 7,5, N(CH₂CH₃)₃] 1,35 (3H, s, 5-CH₃), 2,36 i 2,67 (2H, 2 m, 2'-H₂), 3,06 [6H, q, J 7,2, N(CH₂CH₃)₃], 3,42 (2H, m, 5'-H₂), 3,70 (2H, t, J 4,2 CH₂OH), 3,78 (6H, s, OCH₃), 3,94 (2H, m, POCH₂), 4,30 (1H, m, 4'-H), 5,04 (1H, m, 3'-H), 6,41 (1H, m, 1'-H), 6,83 (4H, d, J 9,0, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,25-7,40 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,60 (1H, br s, 6-H).

Ogólna procedura syntezy fosforanów typu 141.
Reakcję i oczyszczanie prowadzono analogicznie do opisanej wyżej syntezy fosforodiestrów nukleozydowo - aminoalkilowych typu 132 (metoda z wolnymi aminoalkoholami), z tą różnicą, że zamiast aminoalkoholi typu 124 użyto dioli typu 136, a utlenianie prowadzono wobec 10% v/v wody.

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylo - 4-hydroksybutylowy 141c ^. Et₃NH⁺. Wydajność 71%. R_f: 0,33 (faza C), 0,45 (faza D). ¹H NMR, d_H (CDCl₃): 1,29 [9H, t, J 7,5, N(CH₂CH₃)₃] 1,34 (3H, s, 5-CH₃), 1,48 (2H, m, CH₂CH₂OH), 1,80 (2H, m, POCH₂CH₂), 2,39 i 2,49 (2H, 2 m, 2'-H₂), 3,11 [6H, q, J 7,2, N(CH₂CH₃)₃], 3,34 i 3,45 (2H, m, 5'-H₂), 3,57 (2H, t, J 4,1 CH₂OH), 3,82 (6H, s, OCH₃), 4,03 (2H, m, POCH₂), 4,20 (1H, m, 4'-H), 5,01 (1H, m, 3'-H), 6,52 (1H, m, 1'-H), 6,78 (4H, d, J 9,0, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,22-7,41 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,65 (1H, br s, 6-H).

Fosforan 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylo - 5-hydroksypentylowy 141d^. Et₃NH⁺. Wydajność 75%. R_f: 0,38 (faza C), 0,50 (faza D). ¹H NMR, d_H (CDCl₃): 1,29 [9H, t, J 7,5, N(CH₂CH₃)₃], 1,39 (2H, m, CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂), 1,44 (3H, s, 5-CH₃), 1,53 (2H, m, CH₂CH₂OH), 1,78 (2H, m, POCH₂CH₂), 2,38 i 2,46 (2H, 2 m, 2'-H₂), 3,21 [6H, q, J 7,2, N(CH₂CH₃)₃], 3,33 i 3,48 (2H, m, 5'-H₂), 3,61 (2H, t, J 4,1 CH₂OH), 3,78 (6H, s, OCH₃), 4,10 (2H, m, POCH₂), 4,22 (1H, m, 4'-H), 5,12 (1H, m, 3'-H), 6,49 (1H, m, 1'-H), 6,73 (4H, d, J 9,0, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,20-7,39 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,66 (1H, br s, 6-H).

Ogólna metoda syntezy nukleozydowych pochodnych N-(2-cyjanoetylo)aminoalkilowych (147 i 149).
Do roztworu fosforanu 6-aminoheksylowo - tymidyn-3'-ylowego 146 lub N⁴-(6-aminoheksylo)-5-metylocytydyny 148 (0,5 mmola) w 10 ml wodnego roztworu amoniaku (25%) dodano 10 ekw. akrylonitrylu (5,0 mmola, 0,33 ml). Po zakończeniu reakcji (TLC, 15 min.) rozpuszczalnik i nadmiaru akrylonitrylu zostały odparowane pod zmniejszonym ciśnieniem. Fosfodiester 147 wyizolowano w postaci stałej poprzez rozpuszczenie pozostałości w metanolu i strącenie do eteru dietylowego, a nukleozyd 149 oczyszczono za pomocą krótkokolumnowej chromatografii na żelu krzemionkowym stosując liniowy gradient metanolu (0-20% w chlorku metylenu zawierającym 1% Et₃N).

Fosforan tymidyn-3'-ylowo - N-(2-cyjanoetylo)-6-aminoheksylowy 147^. NH₄⁺. Wydajność 85%. R_f: 0,74 (faza D). ¹H NMR, d3OD): 1,45 (4H, m, CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂), 1,65 (4H, m, CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂), 1,88 (3H, s, 5-CH₃), 2,27 i 2,46 (2H, 2 m, 2'-H₂), 2,81 (2H, t, J 6,9, CH₂CN), 2,85 (2H, t, J 7,2, CH₂CH₂CH₂NH), 3,12 (2H, t, J 6,0, CH₂CH₂CN), 3,30 (2H, m, 5'-H₂), 3,89 (2H, dt, J_HH 6,0, J_HP 6,5, POCH₂), 4,15 (1H, m, 4'-H), 4,82 (1H, m, 3'-H), 6,30 (1H, m, 1'-H), 7,86 (1H, br s, 6-H).

N⁴-[N-(2-cyjanoetylo)-6-aminoheksylo]-5-metylocytydyna 149. Wydajność 86%. R_f: 0,43 (faza C). ¹H NMR, d3OD): 1,51 (4H, m, CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂), 1,60 (4H, m, CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂), 1,96 (3H, s, 5-CH₃), 2,15 i 2,26 (2H, 2 m, 2'-H₂), 2,59 (2H, t, J 6,9, CH₂CN), 2,63 (2H, t, J 6,9, CH₂CH₂CH₂NHCH₂), 2,86 (2H, t, J 7,5, CH₂CH₂CN), 3,36 (2H, t, J 7,5, CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂NHCH₂), 3,76 (2H, m, 5'-H₂), 3,92 (1H, m, 4'-H), 4,39 (1H, m, 3'-H), 6,30 (1H, m, 1'-H), 7,75 (1H, br s, 6-H).

Synteza amidofosforanu 3'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - etylowo - N-(6-hydroksyheksylowego) 154. Diester H-fosfonianowy 150 i 6-aminoheksan-1-ol 124e osuszono osobno przez odparowanie z pirydyną. H-Fosfonian 150 rozpuszczono następnie w pirydynie (2 mmol / ml) i dodano równocześnie aminoalkohol 124e (10 ekw.) w pirydynie (20 mmoli / ml) i jod (1,05 ekw.). Nadmiar jodu rozłożono etanotiolem, odparowano rozpuszczalnik a pozostałość rozpuszczono w chlorku metylenu, przemyto NaHCO_{3 aq. sat.}. Fazę organiczną osuszono nad Na₂SO₄ bzw. i odparowano. Produkt 154 oczyszczono na kolumnie z żelem krzemionkowym (0-10% CH₃OH w chlorku metylenu), frakcje zawierające czysty produkt zatężono, rozpuszczono w minimalnej ilości chlorku metylenu i strącono w układzie heksan-eter dietylowy 1:1. Osad odsączono i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Wydajność 80%. A. E.: C: 62,0%, H: 6,7%, N: 5,8%. C₃₉H₅₀N₃O₁₀P zawiera C: 62,3%, H: 6,7%, N: 5,6%. M. S.: MH⁺: 753, M⁺: 752. C₃₉H₅₀N₃O₁₀P ma MH⁺: 753. R_f (dwa diastereoizomery): 0,70 i 0,79 (faza A); 0,71 i 0,81 (faza B2). ¹H NMR, d_H (CDCl₃): 1,20 i 1,32 (3H, 2dt, ³J_HH 6,9, ⁴J_PH 0,6, CH₂CH₃), 1,36 (4H, m, PNHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂OH), 1,38 (3H, s, CH₃), 1,44 (2H, m, NHCH₂CH₂), 1,54 (2H, m, CH₂CH₂OH), 2,41 i 2,63 (2H, 2m, 2'-H₂), 2,86 (2H, m, NHCH₂), 3,42 (2H, m, 5'-H₂), 3,52 (2H, m, CH₂OH), 3,78 (6H, s, OCH₃), 3,97 i 4,06 (2H, q i dq, ³J_HH 7,2 i 7,3, ³J_PH 1,2, POCH₂), 4,26 i 4,30 (1H, 2m, 4'-H), 5,11 (1H, m, 3'-H), 6,34 (1H, m, 1'-H), 6,84 (4H, d, J 9,2, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,23 - 7,40 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,59 i 7,61 (1H, 2s, 6-H).

Synteza amidofosforanu 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-5'-ylowo - 3'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - N-(6-hydroksyheksylowego) 155. Syntezę i oczyszczanie przeprowadzono analogicznie jak dla amidu 154, z tym, że wyjściowym związkiem był H-fosfonian 151. Wydajność 53%. A. E.: C: 68,2%, H: 6,1%, N: 6,0%. C₆₄H₆₈N₅O₁₂P zawiera C: 68,0%, H: 6,1%, N: 6,2%. R_f (dwa diastereoizomery): 0,83 i 0,91 (faza A); 0,80 i 0,89 (faza B2). ¹H NMR, d_H (CDCl₃): 1,22 (4H, m, PNHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂OH), 1,29 i 1,41 (2H, 2m, PNHCH₂CH₂), 1,35 i 1,38 (3H, 2s, CH_3(3'T)), 1,48 (2H, m, CH₂CH₂OH), 1,65 i 1,90 (2H, 2m, 2'_(5'T)-H₂), 1,83 (3H, s, CH_3(5'T)), 2,39 i 2,49 (2H, 2m, 2'_(3'T)-H₂), 2,65 i 2,78 (2H, 2m, PNHCH₂), 3,40 (2H, m, 5'_(3'T)-H₂), 3,56 (2H, m, CH₂OH), 3,65 (2H, m, 5'_(5'T)-H₂), 3,73 (6H, 2s, OCH_3(5'T)), 3,73 - 3,76 (6H, 4s, OCH_3(3'T)), 3,92 i 3,97 (1H, 2m, 4'_(5'T)-H), 4,13 i 4,18 (1H, 2m, 4'_(3'T)-H), 4,26 (1H, m, 3'_(5'T)-H), 5,07 (1H, m, 3'_(3'T)-H), 6,33 (1H, m, 1'_(5'T)-H), 6,41 (1H, m, 1'_(3'T)-H), 6,82 (8H, m, 3, 3', 5, 5'-H z grup DMTr), 7,17 - 7,37 (18H, m, ArH z grup DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,22 i 7,30 (1H, 2s, 6_(5'T)-H), 7,52 i 7,60 (1H, 2s, 6_(3'T)-H).

Synteza fosforanu 3'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 6-aminoheksylowo - etylowego 157. Diester H-fosfonianowy 150 i chlorowodorek 6-aminoheksan-1-olu 153e (10 ekw.) osuszonoosobno przez odparowanie z pirydyną. H-Fosfonian 150 rozpuszczono następnie w pirydynie (2 mmol / ml) i dodano równocześnie chlorowodorek aminoalkoholu 153e w pirydynie (20 mmoli / ml) i jod (1,05 ekw.). Po zakończeniu reakcji (10') nadmiar jodu rozłożono etanotiolem, odparowano pirydynę, pozostały olej rozpuszczono w chlorku metylenu, przemyto NaHCO_{3 aq. sat.} i osuszono nad Na₂SO₄ bzw.Produkt 157 oczyszczono na kolumnie z żelem krzemionkowym (5% v/v NH_{3 aq. 25% w n-}propanolu), frakcje zawierające czysty produkt zatężono i zliofilizowano z zestalonego benzenu. Wydajność 64%. A. E.: C: 61,9%, H: 6,8%, N: 5,4%. C₃₉H₅₀N₃O₁₀P zawiera C: 6 ,3%, H: 6,7%, N: 5,6%. R_f (dwa diastereoizomery): 1,12 i 0,97 (faza A); 1,10 i 0,95 (faza B2). ¹H NMR, d_H (CDCl₃): 1,27 i 1,32 (3H, 2dt, ³J_HH 7,2, ⁴J_PH 1,2, CH₂CH₃), 1,36 (4H, m, POCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂), 1,39 (3H, s, CH₃), 1,49 (2H, m, CH₂CH₂NH₂), 1,66 (2H, m, POCH₂CH₂), 2,40 (2H, m, CH₂NH₂), 2,62 i 2,72 (2H, 2m, 2'-H₂), 3,45 (2H, m, 5'-H₂), 3,79 (6H, s, OCH₃), 4,00 (2H, m, POCH₂CH₂), 4,10 (2H, m, POCH₂CH₃), 4,27 i 4,29 (1H, 2m, 4'-H), 5,12 (1H, m, 3'-H), 6,45 (1H, m, 1'-H), 6,84 (4H, d, J 8,7, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,25 - 7,39 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,57 (1H, s, 6-H).

Synteza fosforanu 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-5'-ylowo - 3'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - 6-aminoheksylowego 158. Syntezę i oczyszczanie przeprowadzono analogicznie jak dla fosforanu 157, z tym, że wyjściowym związkiem był H-fosfonian 151. Wydajność 53%. A. E.: C: 68,3%, H: 6,1%, N: 6,1%. C₆₄H₆₈N₅O₁₂P zawiera C: 68,0%, H: 6,1%, N: 6,2%. R_f (dwa diastereoizomery): 1,28 i 1,20 (faza A); 1,30 i 1,22 (faza B₂). ¹H NMR, d_H (CDCl₃): 1,27 (4H, m, POCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂), 1,36 i 1,37 (3H, 2s, CH_3(3'T)), 1,53 (2H, m, CH₂CH₂NH₂), 1,55 (2H, m, POCH₂CH₂), 1,68 i 1,92 (2H, 2m, 2'_(5'T)-H₂), 1,82 I 1,85 (3H, 2s, CH_3(5'T)), 2,39 i 2,57 (2H, 2m, 2'_(3'T)-H₂), 2,76 (2H, m, CH₂NH₂), 3,35 i 3,47 (2H, 2m, 5'_(3'T)-H₂), 3,65 (2H, m, 5'_(5'T)-H₂), 3,73 (6H, 2s, OCH_3(5'T)), 3,74, 3,76 i 3,77 (6H, 3s, OCH_3(3'T)), 3,83 (2H, m, POCH₂), 3,95 (1H, m, 4'_(5'T)-H), 4,09 i 4,19 (1H, 2m, 4'_(3'T)-H), 4,25 (1H, m, 3'_(5'T)-H), 5,10 (1H, m, 3'_(3'T)-H), 6,37 (1H, m, 1'_(5'T)-H), 6,46 (1H, m, 1'_(3'T)-H), 6,83 (8H, m, 3, 3', 5, 5'-H z grup DMTr), 7,22 - 7,34 (18H, m, ArH z grup DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,22 (1H, 2s, 6_(5'T)-H), 7,51 i 7,56 (1H, 2s, 6_(3'T)-H).

Synteza amidofosforanu 3'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-3'-ylowo - N-(6-hydroksyheksylowego) 160^. Et₃NH⁺. Syntezę przeprowadzono analogicznie jak dla amidu 154, z tym, że wyjściowym związkiem był H-fosfonian 152, a utlenianie prowadzono w acetonitrylu. Po zakończeniu reakcji odparowano acetonitryl, pozostały olej rozpuszczono w chlorku metylenu, przemyto NaHCO_{3 aq. sat.} i osuszono nad Na₂SO_{4 bzw.}. Rozpuszczalnik odparowano, a pozostałość rozpuszczono w pirydynie. Do roztworu dodano równą objętość 25% NH_{3 aq.} i pozostawiono na noc w temp. pok. Roztwór następnie odparowano i związek 160 oczyszczono na kolumnie z żelem krzemionkowym (0-15% CH₃OH w chlorku metylenu zawierającym 1% Et₃N). Frakcje zawierające czysty produkt zatężono, rozpuszczono w minimalnej ilości chlorku metylenu i strącono w układzie heksan-eter dietylowy 1:1. Osad odsączono i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Wydajność 54%. A. E.: 64,6%, H: 7,4%, N: 7,2%. C₄₁H₅₇N₄O₈P zawiera C: C: 64,4%, H: 7,5%, N: 7,3%. R_f: 0,32 (faza C), 0,47 (faza D). ¹H NMR, d_H (CDCl₃): 1,30 (6H, m, PNHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂OH), 1,34 (3H, s, CH₃), 1,36 [9H, t, J 7,5, N(CH₂CH₃)₃], 1,50 (2H, m, CH₂CH₂OH), 2,35 i 2,64 (2H, 2m, 2'-H₂), 2,77 (2H, m, NHCH₂), 3,09 [6H, q, J 7,5, N(CH₂CH₃)₃], 3,44 (2H, m, 5'-H₂), 3,56 (2H, t, J 6,3, CH₂OH), 3,77 (6H, s, OCH₃), 4,26 (1H, m, 4'-H), 4,94 (1H, m, 3'-H), 6,39 (1H, m, 1'-H), 6,82 (4H, d, J 9,0, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,18-7,40 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,60 (1H, s, 6-H).

Synteza amidofosfonianu 5'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)-tymidyn-3'-ylowo - N-butylowego 162. H-Fosfonian nukleozydowo - arylowy 177 (0,5 mmola) traktowany był butyloaminą (0,25 ml, 2,5 mmola) w pirydynie (5 ml) przez 5'. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono chlorkiem metylenu (10x) i przemyto NaCl_{aq. sat.} Faza organiczna została osuszona nad bezwodnym Na_2SO4 i odparowana do gęstego oleju. Zanieczyszczenia polarne oddzielono od produktu 162 poprzez szybkie sączenie na kolumnie z żelem krzemionkowym (związek 162 jest częściowo nietrwały podczas chromatografii co jest przyczyną jego niskiej wydajności po oczyszczeniu). Jako fazę wymywającą stosowano chlorek metylenu z metanolem (10%). Odpowiednie frakcje połączono, odparowano, rozpuszczono w chlorku metylenu. Produkt 162 wydzielono przez wytrącenie do heksanu i po odsączeniu wysuszono w próżni. Wydajność 25%. A. E.: C: 63,2%, H: 6,2%, N: 6,3%; C₃₅H₄₂N₃O₈P zawiera C: 63,3%, H: 6,4%, N: 6,3%. R_f: 1,16 (faza A), 1,34 (faza B₂). ¹H NMR, d_H (CDCl₃): 0,88 i 0,92 (3H, 2t, J 7,2 i 7,5, CH₂CH₃CH₃)1,24-1,51 (4H, m, CH₂CH₂CH₂CH₃), 1,39 i 1,41 (3H, 2s, 5 - CH₃), 2,43 i 2,57 (2H, m, 2'-H₂), 2,80 i 2,89 (2H, m, NHCH2CH2), 3,38 i 3,52 (2H, m, 5'-H₂), 3,79 (6H, s, OCH₃), 4,24 (1H, m, 4'-H), 5,16 (1H, m, 3'-H), 5,83 i 7,99 (1H, 2d, J 646,8 i 648,6, PH), 6,46 (1H, m, 1'-H), 6,84 (4H, d, J 9,0, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,24 - 7,39 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,56 i 7,58 (1H, 2s, 6-H), 8,6 (1H, br m, NH, wymiana z D₂O);

Ogólna procedura syntezy H-fosfonianów bis(aminoalkilowych) (chlorowodorków) typu 165. Fosforyn difenylowy rozpuszczony w acetonitrylu (1 mmol / ml) traktowany był aminoalkoholem (2 ekw.) w ciągu 5'. Przez roztwór przepuszczano następnie gazowy bezwodny chlorowodór i produkt typu 165 (monochlorowodorek, jak stwierdzono na podstawie ilości strąconego AgCl po dodaniu wodnego roztworu AgNO₃) wytrącał się w postaci gęstego oleju. Roztwór zdekantowano, pozostały olej przemyto acetonitrylem, rozpuszczono w minimalnej ilości DMSO i strącono w acetonitrylu (nadmiar 10x) uzyskując czysty produkt typu 165, ponownie jako gęsty olej. Po zdekantowaniu rozpuszczalnika pozostały olej przemyto acetonitrylem i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem.

H-fosfonian bis(2-aminoetylowy) (chlorowodorek)165a. Wydajność 33%. S. M.: MH⁺: 169. C₄H₁₄N₂O₃PCl ma (M⁺ - Cl): 169; ¹H NMR, d3)₂SO]: 3,11 (4H, bm, CH₂NH₃⁺), 4,31 (4H, m, POCH₂), 5,81 i 8,23 (1H, d, J 720,6, HP).

H-fosfonian bis(2-aminopropylowy) (chlorowodorek) 165b. Wydajność 43%. S. M.: MH⁺: 197. C₆H₁₈N₂O₃PCl ma (M⁺ - Cl): 197; ¹H NMR, d3)₂SO]: 1,96 (4H, m, CH₂CH₂CH₂), 2,87 (4H, t, J 7,2, CH₂NH₃⁺), 4,12 (4H, m, POCH₂), 5,73 i 8,08 (1H, d, J 705,3, HP).

H-fosfonian bis(2-aminobutylowy) (chlorowodorek)165c. Wydajność 45%. S. M.: MH⁺: 225. C₈H₂₂N₂O₃PCl ma (M⁺ - Cl): 225; ¹H NMR, d3)₂SO]: 1,45 (4H, m, CH₂CH₂NH₃⁺), 1,60 (4H, m, POCH₂CH₂), 2,79 (4H, m, CH₂NH₃⁺), 4,02 (4H, m, POCH₂), 5,71 i 8,04 (1H, d, J 697,2, HP).

H-fosfonian bis(2-aminoheksylowy) (chlorowodorek)165e. Wydajność 32%. S. M.: MH⁺: 281. C₁₀H₂₆O₃N₂PCl ma (M⁺ - Cl): 281; ¹H NMR, d3)₂SO]: 1,33 (8H, m, CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂), 1,59 (8H, m, CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂), 2,74 (4H, t, J 7,5, CH₂NH₃⁺), 4,00 (4H, m, 5,67 i 7,99 (1H, d, J 694,5, HP).

Ogólna procedura syntezy H-fosfonianów aminoalkilowych typu 173. Do roztworu fosforynu difenylowego (4,2 ml, 20 mmoli) w acetonitrylu (250 ml) dodano aminoalkohol typu 124 (40 mmoli). Po 15' dodano wody (1 ml, 55,5 mmola) i mieszaninę pozostawiono w temp. pok. na 5 dni. Wytrącone białe kryształy produktu 173 zebrano, przemyto dwukrotnie eterem i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem.

H-Fosfonian 5-aminopentylowy 173d. Wydajność 79%. ¹H NMR, d2O): 1,49 (2H, m, CH₂CH₂CH₂), 1,67 (4H, m, CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂), 3,03 (2H, t, J 7,2, CH₂NH₃⁺), 3,80 (2H, dt, J_HH 6,8, J_HP 8,3, POCH₂), 6,74 (1H, d, J 631,9, HP).

H-Fosfonian 6-aminoheksylowy 173e. Wydajność 71%. ¹H NMR, d2O): 1,41 (4H, m, CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂), 1,64 (4H, m, CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂), 2,99 (2H, t, J 7,3, CH₂NH₃⁺), 3,86 (2H, dt, J_HH 6,6, J_HP 8,4, POCH₂), 6,70 (1H, d, J 632,6, HP).

H-Fosfonian 2-(2-aminoetoksy)etylowy 173f. Wydajność 83%. ¹H NMR, d2O): 3,21 (2H, t, J 4,9 CH₂NH₃⁺), 3,74 (2H, t, J 4,5, POCH₂CH₂), 3,79 (2H, t, J 5,1, CH₂CH₂NH₃⁺), 4,01 (2H, m, POCH₂), 6,74 (1H, d, J 639,2, HP).

Synteza fosforanu 3'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo-tymidyn-5'-ylowo - 2-aminoetylowego 176a^. Et₃NH⁺. Syntezę i oczyszczanie przeprowadzono wg opisanej powyżej procedury otrzymywania fosforodiestrów nukleozydowo - aminoalkilowych 139a-e (metoda z preacylacją aminoalkoholi, str. *). Wydajność 0,15 g (45%). A. E.: C: 57,2%; H: 6,0%; N: 6,1%. C₃₃H₃₈N₃O₁₀P x 1,5 H₂O zawiera C: 57,0%; H: 6,0%; N: 6,1%); R_f: 0,23 (faza C), 0,56 (faza D); ¹H NMR, d_H (CDCl₃): 1,71 (3H, s, CH₃), 1,73 (2H, m, 2'-H₂), 2,98 (2H, m, CH₂NH₃⁺), 3,53 (2H, m, POCH₂), 3,70 (6H, s, OCH₃), 3,83 (2H, m, 4'-H), 4,31 (1H, m, 3'-H), 6,18 (1H, m, 1'-H), 6,79 (4H, d J 7,2, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,18 - 7,42 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,44 (1H, s, 6-H), 8,26 (1H, br s, N³H, wymiana z D₂O).

Ogólna procedura syntezy fosforanowych diestrów nukleozydowo - aminoalkilowych 176b, c, e.Syntezę przeprowadzono wg opisanej procedury otrzymywania fosforodiestrów nukleozydowo - aminoalkilowych 139b-e (metoda z wolnymi aminoalkoholami, str. *).

Fosforan 3'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-5'-ylowo - 3-aminopropylowy 176b ^. Et₃NH⁺. Wydajność 78%. A. E.: C: 57,6%; H: 6,0%; N: 6,0%. C₃₄H₄₀N₃O₁₀P x 1,5 H₂O zawiera C: 57,6%; H: 6,1%; N: 5,9%); R_f: 0,13 (faza C), 0,34 (faza D); ¹H NMR, d_H (CDCl₃): 1,78 (3H, s, CH₃), 1,88 (2H, m, 2'-CH₂), 1,98 (2H, m, POCH₂CH₂), 2,98 (2H, m, CH₂NH₃⁺), 3,54 (2H, m, POCH₂), 3,73 (6H, s, OCH₃), 3,78 (2H, m, 5'-H₂), 3,85 (1H, m, 4'-H), 6,30 (1H, m, 1'-H), 6,79 (4H, d, J 8,2, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,18 - 7,42 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,44 (1H, s, 6-H), 8,26 (1H, br s, N³H, wymiana z D₂O).

Fosforan 3'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-5'-ylowo - 4-aminobutylowy 176c ^. Et₃NH⁺. Wydajność 85%. A. E.: C: 58,3%; H: 6,2%; N: 5,7%. C₃₅H₄₂N₃O₁₀P x 1,5 H₂O zawiera C: 58,2; H: 6,3%; N: 5,8%); R_f 0,18 (faza C), 0,30 (faza D); ¹H NMR, d3) 1,61 (2H, m, CH₂CH₂NH₃⁺), 1,75 (2H, m, POCH₂CH₂), 1,80 (2H, m, 2'-H₂), 1,81 (3H, s, CH₃), 2,86 (2H, m, CH₂NH₃⁺), 3,51 (2H, m, POCH₂), 3,74 (6H, s, OCH₃), 3,78 (2H, m, 5'-H₂), 3,93 (1H, m, 4'-H), 4,32 (1H, m, 3'-H), 6,30 (1H, m, 1'-H), 6,80 (4H, d, J 8,2, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,17 - 7,46 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,48 (1H, s, 6-H), 8,21 (1H, br s, N³H, wymiana z D₂O).

Fosforan 3'-O-(4,4'-dimetoksytrytylo)tymidyn-5'-ylowo - 6-aminoheksylowy 176e^. Et₃NH⁺. Wydajność 51%. A. E.: C: 58,9%; H: 6,6%; N: 5,7%. C₃₇H₄₆N₃O₁₀P x 1,5 H₂O zawiera C: 59,2%; H: 6,6%; N: 5,6%); R_f: 0,17 (faza C), 0,41 (faza D); ¹H NMR, d_H (CDCl₃) 1,36 (4H, m, POCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂NH₃⁺), 1,48 (2H, m, CH₂CH₂NH₃⁺), 1,61 (2H, m, POCH₂CH₂), 1,75 (2H, m, 2'-H₂), 1,82 (3H, s, CH₃), 2,81 (2H, m, CH₂NH₃⁺), 3,52 (2H, m, POCH₂), 3,65 (2H, m, 5'-H₂), 3,78 (6H, s, OCH₃), 3,88 (1H, m, 4'-H), 4,31 (1H, m, 3'-H), 6,34 (1H, m, 1'-H), 6,80 (4H, d, J 8,1, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,15 - 7,41 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H), 7,53 (1H, s, 6-H).

Synteza H-fosfonianu 2-cyjanoetylowego 180. Do roztworu 2-cyjanoetanolu (20 mmoli, 1,36 ml) w pirydynie (5 ml) dodano fosforyn difenylowy (10 mmoli, 2,1 ml). Po 10' dodano 25% wodny roztwór amoniaku (15 ml), wymieszano do uzyskania homogeniczności i pozostawiono na 10'. Mieszaninę rozpuszczalników odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a resztę wody usunięto przez odparowanie dodanego toluenu. Pozostałość roztarto z Et₂O (3 x 20 ml) dla usunięcia fenolu i nadmiaru alkoholu. Powstały biały krystaliczny osad produktu 179 odfiltrowano, przemyto Et₂O i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Wydajność 82%. ¹H NMR, d _H (D₂O): 2,68 (2H, t, J 6,2, CH₂CN), 3,90 (2H, dt, J_HH 6,2, J_HP 8,4, POCH₂), 6,61 (1H, d, J 640,8, PH).

Ogólna procedura syntezy N-dimetoksytrytylowanych H-fosfonianów aminoalkilowych typu 182. Odpowiedni H-fosfonian aminoalkilowy 173 (5 mmoli) i DBU (10 mmoli, 1,50 ml) odparowano dwukrotnie z pirydyną i pozostałość rozpuszczono w tym samym rozpuszczalniku. Następnie dodano DMTr-Cl (6 mmoli, 2,03 g) i mieszaninę pozostawiono na noc. Po standardowym przerobie z wodnym roztworem NaHCO₃ i chromatografii na żelu krzemionkowym (0-10% metanolu w CH₂Cl₂-Et₃N 99 : 1 v/v), produkt 182 został wyizolowany i zliofilizowany z zestalonego benzenu.

H-Fosfonian N-(4,4'-dimetoksytrytylo)-5-aminopentylowy 182d^. Et₃NH⁺. Wydajność 81%. ¹H NMR, d3Cl): 1,25 (2H, m, CH₂CH₂CH₂), 1,31 [9H, t, J 7,5, N(CH₂CH₃)₃], 1,56 (2H, m, POCH₂CH₂), 1,75 (2H, m, NHCH₂CH₂), 2,38 (2H, m, NHCH₂), 3,00 [6H, q, J 7,5, N(CH₂CH₃)₃], 3,72 (2H, dt, J 8,1, POCH₂), 6,55 (1H, d, J 626,1, HP), 6,83 (4H, d, J 9,0, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,16-7,40 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H).

H-Fosfonian N-(4,4'-dimetoksytrytylo)-6-aminoheksylowy 182e^. Et₃NH⁺. Wydajność 74%. ¹H NMR, d3Cl): 1,23 (4H, m, CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂), 1,30 [9H, t, J 7,5, N(CH₂CH₃)₃], 1,54 (2H, m, POCH₂CH₂), 1,72 (2H, m, NHCH₂CH₂), 2,40 (2H, m, NHCH₂), 3,04 [6H, q, J 7,5, N(CH₂CH₃)₃], 3,71 (2H, dt, J 8,1, POCH₂), 6,58 (1H, d, J 628,1, HP), 6,82 (4H, d, J 9,0, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,18-7,40 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H).

H-Fosfonian N-(4,4'-dimetoksytrytylo)-2-(2-aminoetoksy)etylowy 182f^. Et₃NH⁺. Wydajność 89%. ¹H NMR, d3Cl): 1,27 [9H, t, J 7,5, N(CH₂CH₃)₃], 2,37 (2H, bs, NHCH₂), 2,99 [6H, q, J 7,5, N(CH₂CH₃)₃], 3,43 (2H, bs, POCH₂CH₂), 3,54 (2H, bs, NHCH₂CH₂), 3,79 (2H, bs, POCH₂), 6,61 (1H, d, J 625,1, HP), 6,75 (4H, d, J 9,0, 3, 3', 5, 5'-H z grupy DMTr), 7,10-7,42 (9H, m, ArH z grupy DMTr oprócz 3, 3', 5, 5'-H).

Protokół fosfonylacji oligonukleotydów typu I do 5'-H-fosfonianów oligonukleotydów typu II.

A. Metoda z użyciem kwasu pirofosfonowego.
 

B. Metoda z użyciem fosforynu difenylowego.
 

Protokół funkcjonalizacji oligonukleotydów typu I do 5'-aminoalkilofosforanów oligonukleotydów typu VI.

A. Podejście z kondensacją wobec NEP-Cl.
 

B. Podejście z fosforynem difenylowym
 

C. Podejście z kondensacją oksydatywną (wersja z H-fosfonianem 2-cyjanoetylowym)
 

D. Podejście z kondensacją oksydatywną (wersja z fosforynem difenylowym)
 

E. Podejście z syntonem nienukleotydowym
 

Protokół przyłączania grup reporterowych do sfunkcjonalizowanych oligonukleotydów typu VI na podłożu stałym.