Prace dyplomowe

Badania nad funkcjonalizacją oligonukleotydów według Wariantu II

Funkcjonalizacja oligonukleotydów na podłożu stałym

Wprowadzanie grup funkcyjnych na koniec 5' oligonukleotydu w reakcji kondensacji oksydatywnej wymaga, aby na tym końcu oligomeru znajdowała się diestrowa reszta H-fosfonianowa. W łańcuchu oligonukleotydowym natomiast nie mogą znajdować się grupy H-fosfonianowe, które w procesie utleniania również uległyby modyfikacji. Dlatego też według tego podejścia funkcjonalizować można jedynie oligomery otrzymane metodą amidofosforynową. Pierwszym etapem Wariantu II jest wprowadzenie grupy alkilo-H-fosfonianowej na koniec 5' oligomeru. Po utlenieniu w obecności chlorowodorku aminoalkoholu, diestrowa grupa H-fosfonianowa przekształci się w triestrową grupę fosforanową. Ponieważ tego typu ugrupowanie jest częściowo nietrwałe w warunkach standardowego odblokowania, należy tak dobrać grupę alkilową, aby podczas traktowania amoniakiem była ona usuwana selektywnie. Te warunki spełnia powszechnie stosowana w chemii oligonukleotydów grupa 2-cyjanoetylowa. Na podstawie wcześniej opisanych w niniejszej rozprawie wyników mogę zaproponować dwie metody wprowadzania ugrupowania 2-cyjanoetylo-H-fosfonianowego na koniec 5' oligonukleotydów.

Synteza 5'-(2-cyjanoetylo)-H-fosfonianów oligonukleotydów

Kondensacja z H-fosfonianem 2-cyjanoetylowym

W pierwszym podejściu, analogicznym do opisanego przez Venyaminovą i wsp.,⁸⁵ założyłem, że wprowadzenie reszty 2-cyjanoetylo-H-fosfonianowej do oligonukleotydu I powinno zachodzić w standardowych cyklach reakcji stosowanych w syntezie oligonukleotydów metodą H-fosfonianową. W ten sposób, fosfonylacja oligomeru związanego z podłożem będzie rutynowym cyklem syntetycznym.

Zgodnie z tymi założeniami, oligomer I traktowałem H-fosfonianem 2-cyjanoetylowym (10min., 0,2 M; 40 ml; Py-CH₃CN 1:1) w obecności PivCl jako czynnika kondensującego (0,3 M; 80 m l; Py-CH₃CN 1:1 v/v) (Schemat 42). Analiza (PAGE) surowej mieszaniny poreakcyjnej (po usunięciu grup ochronnych) wykazała obecność praktycznie jednego produktu, 5'-H-fosfonianu oligomeru (II). Taki wynik wskazuje, że reakcja fosfonylacji w powyższych warunkach zachodzi ilościowo, a otrzymany 5'-(2-cyjanoetylo)-H-fosfonian oligonukleotydu może być stosowany do dalszych etapów funkcjonalizacji oligomeru związanego z podłożem.

VII

VIII

Schemat 42

Dodatkową, ważną informacją wynikającą z tego doświadczenia jest to, że otrzymany nową metodą (str. *), krystaliczny H-fosfonian 2-cyjanoetylowy, może być z powodzeniem stosowany jako efektywny i syntetycznie użyteczny czynnik fosfonylujący.

Reakcja z fosforynem difenylowym

Drugą badaną metodą syntezy 5'-(2-cyjanoetylo)-H-fosfonianów oligomerów typu VIII było podejście, w którym na pierwszym etapie zastosowałem fosforyn difenylowy w celu wygenerowania, opisanego już w poprzednich częściach rozprawy (str. *), reaktywnego ugrupowania fenylo-H-fosfonianowego na końcu 5' oligonukleotydu VII. Oligomer VII poddany transestryfikacji 2-cyjanoetanolem (0,2M roztwór w pirydynie; 1 h), przekształcał się ilościowo (PAGE j. w.) w 5'-(2-cyjanoetylo)-H-fosfonian oligonukleotydu VIII.

Obydwie opisane powyżej metody syntezy 5'-(2-cyjanoetylo)-H-fosfonianów oligonukleotydów typu VIII okazały się równie skuteczne. Metoda bezpośredniej fosfonylacji aktywowanym (PivCl) H-fosfonianem 2-cyjanoetylowym jest szybsza i nie wymaga zmiany oprogramowania jednostki sterującej pracą syntetyzera. Natomiast podejście z użyciem fosforynu difenylowego, nie angażujące chlorku piwaloilu jako czynnika kondensującego, można polecać w przypadkach gdy oligonukleotyd zawiera modyfikowane jednostki nukleotydowe podatne na acylowanie.

Kondensacja oksydatywna

W celu wprowadzenia funkcji aminoalkilowej, oligomer typu VIII poddany został działaniu (10 min.) pirydynowego roztworu utleniającego zawierającego: jod (3%), chlorowodorek aminopentanolu (0,2M) i tetrazol (0,5M). Zgodnie z wynikami doświadczeń na związkach modelowych (str. *), protonowany aminoalkohol powinien przyłączać się chemoselektywnie tworząc fosforotriester. Analiza produktów reakcji po ich odblokowaniu (PAGE, Zdjęcie 4) wykazała obok pożądanego produktu kondensacji (sfunkcjonalizowanego oligonukleotydu VI), obecność znacznej ilości (~ 50%) 5'-fosforanu oligonukleotydu, powstałego, być może, wskutek obecności wody, której zawartości w medium utleniającym nie udało się uniknąć.

linia A: T₁₀ (I)
linia B: analizowana mieszanina
linia C: 5'-aminopentylo-T₁₀ (VI)
linia D: 5'-H-fosfonian-T₁₀ (II)

Zdjęcie 4

Kilkakrotne powtarzanie reakcji, w których możliwie starannie przygotowano substraty, prowadziło do bardzo podobnych rezultatów. Można więc przypuszczać, że obok cząsteczek wody, także niedostateczny udział tetrazolu w procesie utleniania może wpływać na powstawanie innych produktów utleniania niż spodziewane fosforotriestry. Chodzi o to, że w reakcjach oksydatywnej kondensacji prowadzonych w roztworze, tetrazol skutecznie ukierunkowywał te reakcje na powstawanie fosforotriestrów (str. *). Jest prawdopodobne, że w układzie heterogennym tworzenie domniemanych, przejściowych fosforotetrazolidów jest znacznie utrudnione. W konsekwencji, z utworzonego na pierwszym etapie utleniania jodofosforanu powstają także inne pochodne (np. pirydyniowy addukt fosforodiestru i produkty jego dealkilacji), które uniemożliwiają tworzenie pożądanych fosforotriestrów. Mając na uwadze powtarzalność wyników kilkakrotnie wykonanych reakcji oksydatywnych kondensacji, sądzę, że niedostateczna efektywność działania tetrazolu jako katalizatora nukleofilowego, w powyższych reakcjach prowadzonych w układzie heterogennym, mogła mieć znaczący (o ile nie decydujący) wpływ na charakter i stosunek ilościowy otrzymanych produktów (fosforodi- i monoestry vs fosforotriestry).

Podsumowując, próby funkcjonalizacji 5'-(2-cyjanoetylo)-H-fosfonianów oligonukleotydów związanych z podłożem stałym na drodze oksydatywnej kondensacji z aminoalkoholem zakończyły się połowicznym sukcesem. W przeciwieństwie do oksydatywnej kondesacji przebiegającej w roztworze, w układzie heterogennym reakcje te prowadziły do prawie równomolowych ilości di- i triestrów fosforanowych. Tak więc, na obecnym etapie zaawansowania prac nie mogę polecać tego podejścia jako wydajnej metody syntezy oligonukleotydów sfunkcjonalizowanych grupami aminoalkilowymi.