Prace dyplomowe

Wstęp

Wśród dotychczas opisanych metod syntezy oligonukleotydowych sond molekularnych niosących grupy reporterowe o nieradioizotopowej detekcji, trudno jest wyróżnić taką, którą można by uznać za podejście uniwersalne, pozwalające na możliwie prostą, szybką, tanią i wydają syntezę produktów docelowych. Ocenę swoją opieram o być może nieco wygórowane kryteria, jednakże uważam, że tylko takie mogą przyczynić się do dalszego udoskonalania metod i w efekcie do coraz to bardziej uniwersalnych procedur otrzymywania nieradioizotopowych sond molekularnych.

Podejmując temat pracy doktorskiej przyjąłem następujące kryteria metodyczne i ekonomiczne jej realizacji:

stosowane odczynniki powinny być proste, tanie i łatwo dostępne,
metody syntezy powinny być nieskomplikowane, szybkie i łatwe w realizacji, bez angażowania unikalnego, specjalistycznego wyposażenia,
stosowanie wielu różnych grup blokujących powinno być ograniczone lub wyeliminowane,
w zależności od potrzeb możliwe powinno być wprowadzanie różnych znaczników nieradioizotopowych,
metody modyfikacji oligonukleotydu powinny być tak dobrane, by można je przeprowadzić w sposób zautomatyzowany, z wykorzystaniem syntetyzera DNA.

Powyższe kryteria doprowadziły do powstania koncepcji realizacji pracy według przedstawionego Schematu 16.

Ze względu na fakt, że metody realizacji poszczególnych etapów syntezy były jak dotąd nieznane, koncepcja uwzględnia trzy warianty dochodzenia do docelowych modyfikowanych oligonukleotydów.

Wariant I to modyfikacja stopniowa, w którym oligomer z odsłoniętą resztą 5'-OH poddaje się działaniu kolejnych prostych reagentów, będących fragmentami ugrupowania modyfikującego oligomer.

Wariant II to wprowadzenie na koniec 5' oligomeru nienukleotydowego monoestru H-fosfonianowego i modyfikację tak otrzymanego ugrupowania diestrowego w drodze kondensacji oksydatywnej.

Wariant III zakłada syntezę jednostki nienukleotydowej niosącej grupę funkcyjną (synton nienukleotydowy). Zastosowanie takiego podejścia pozwala na jednoetapową funkcjonalizację oligomeru.

Schemat 16

We wszystkich przedstawionych podejściach etapem kluczowym jest dochodzenie do oligomeru niosącego na końcu 5' ugrupowanie aminoalkilowe z wolną grupą -NH₂, umożliwiającą przyłączenie wybranej grupy reporterowej. Jak już wcześniej wspomniano, metody modyfikacji czy syntezy komponentów jej służących, spełniające kryteria stawiane w tej pracy, nie były dotąd znane. Dlatego też w swojej pracy doktorskiej podjąłem badania nad opracowaniem nowych metod syntezy komponentów i nowych procedur modyfikacji oligonukleotydów.

Zgodnie z metodyką ogólnie przyjętą w chemii oligonukleotydów, na pierwszym etapie przeprowadziłem badania na związkach modelowych, a reakcje prowadziłem w roztworze. Na podstawie uzyskanych wyników zaproponowałem i zoptymalizowałem protokoły modyfikacji oligomerów na podłożu stałym.